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5-HT_(2C)R与EGFP-NFAT2共表达细胞株的构建
1
作者 王龙雨 李玉蕾 +1 位作者 周培岚 苏瑞斌 《中国药理学通报》 北大核心 2025年第7期1391-1396,共6页
目的建立5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C)receptor,5-HT_(2C)R)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)共表达细胞株。方法人源5-HT_(2C)R质粒... 目的建立5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C)receptor,5-HT_(2C)R)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的活化T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)共表达细胞株。方法人源5-HT_(2C)R质粒转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,经潮霉素(Hygro)压力筛选到稳定表达5-HT_(2C)R的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞。使用RT-qPCR和Western blot法检测该细胞株中5-HT_(2C)R的mRNA和蛋白表达水平;用核转位功能实验验证U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞受体功能的特异性;验证5-HT、LSD、DOM、DOI、赛洛西宾(PSI)和利舒脲(LIS)对5-HT_(2C)R的激活能力。结果筛选得到58号细胞为最强激活的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R单克隆细胞株。RT-qPCR和Western blot结果显示,1~15代内,U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株稳定表达5-HT_(2C)R mRNA和蛋白。1~15代内,Vabicaserin对U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞株的激活能力稳定,5-HT_(2C)R特异性拮抗剂SB242084能够拮抗Vabicaserin的作用。5-HT、LIS、PSI能诱导U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞部分核转位,而LSD、DOM、DOI没有作用。结论成功构建了共表达5-HT_(2C)R和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-5-HT_(2C)R细胞,可用于靶向5-HT_(2C)R的高活性小分子化合物筛选。 展开更多
关键词 5-羟色胺2C受体 活化T细胞核因子2 核转位 高内涵筛选系统 Vabicaserin 5-羟色胺
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α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建 被引量：1
2
作者 王晓璇 李玉蕾 +1 位作者 周培岚 苏瑞斌 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期587-594,共8页
目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^... 目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5)mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5)mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8)mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。 展开更多
关键词 α1A-肾上腺素能受体 活化T细胞核因子2 核转位 去甲肾上腺素 高内涵筛选系统
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