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髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定 被引量：1
1
作者 吴旭铭 王卉卉 +5 位作者 朱向玲 周园园 王安琪 张慧茹 刘崇 涂佳杰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期413-417,共5页
目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2... 目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。 展开更多
关键词 髓系特异性 Spi1 基因敲除 CRISPR/Cas9 Cre/LoxP PCR Western blot
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髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建和表型初步分析 被引量：1
2
作者 李亚婷 张洁 +3 位作者 尹荣华 杨晓明(指导) 任广明(指导) 葛志强(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期580-585,共6页
目的:构建髓系特异性Abro1(Abraxas brother 1)基因敲除小鼠,并初步分析其对小鼠造血系统及LPS诱导败血症的影响。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre/LoxP重组系统构建Abro1^(flox/+)小鼠,将Abro1^(flox/+)雌雄小鼠自交,子代得到Ab... 目的:构建髓系特异性Abro1(Abraxas brother 1)基因敲除小鼠,并初步分析其对小鼠造血系统及LPS诱导败血症的影响。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre/LoxP重组系统构建Abro1^(flox/+)小鼠,将Abro1^(flox/+)雌雄小鼠自交,子代得到Abro1^(flox/flox)基因型小鼠。Abro1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配,子代得到Abro1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Abro1^(flox/flox)交配,最终得到的Abro1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Abro1基因敲除小鼠,即MKO小鼠;Abro1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(−)小鼠作为野生型小鼠,即WT小鼠。提取WT和MKO小鼠尾基因组DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型。提取WT和MKO小鼠免疫细胞蛋白,Western blot检测ABRO1蛋白表达。流式细胞术分析小鼠骨髓和外周血免疫细胞组成,检测MKO小鼠对造血系统的影响。LPS处理WT和MKO小鼠3 h,检测血清中相关生化指标变化以及炎症因子分泌情况。结果:PCR和Western blot结果显示髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建成功。流式细胞术结果显示WT和MKO小鼠骨髓和外周血中髓系细胞(CD11b^(+)、CD11b^(+)Ly6G^(+)、CD11b^(+)Ly6C^(+))和淋巴细胞组成(CD3^(+)、B220^(+))无差异。LPS诱导败血症实验中,MKO小鼠相关生化指标和炎症因子水平均低于WT小鼠,表明MKO小鼠可抵抗LPS诱导的败血症。结论:成功构建ABRO1 MKO敲除小鼠,发现MKO小鼠造血系统正常,但可抵抗LPS诱导的败血症,ABRO1 MKO小鼠的建立为揭示ABRO1在免疫细胞亚群中的差异性调控机制提供了良好的动物模型。 展开更多
关键词 ABRO1 CRE/LOXP重组系统 髓系特异性基因敲除小鼠 造血分化 败血症
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Notch1在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中的作用及机制 被引量：2
3
作者 邵宇云 王涵 +3 位作者 王潇 戴晶晶 李军 蒋龙凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第10期1350-1355,1365,共7页
目的:探讨Notch1信号通过转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)调控对乙酰氨基酚(acetyl-para-aminophenol,APAP)诱导的肝损伤(APAP induced liver injury,AILI)的作用机制。方法:髓系特异... 目的:探讨Notch1信号通过转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)调控对乙酰氨基酚(acetyl-para-aminophenol,APAP)诱导的肝损伤(APAP induced liver injury,AILI)的作用机制。方法:髓系特异性Notch1敲除(Notch1^(M-KO))和对照floxed Notch1(Notch1^(FL/FL))小鼠通过腹腔注射APAP构建AILI模型。留取小鼠血清标本,用全自动生化分析仪及酶联免疫反应分析法检测肝功能和细胞因子。留取小鼠肝组织标本,HE染色观察肝组织病理损伤情况,使用Suzuki评分评估肝组织损伤程度,免疫印迹法检测TAK1、磷酸化TAK1(p-TAK1)、p65、磷酸化p65(p-p65)、Caspase-8(Casp-8)、受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、磷酸化混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,p-MLKL)的表达,免疫荧光染色观察CD11b、p-TAK1的表达及活性氧(reactive oxygen species ROS)水平。结果:小鼠腹腔注射APAP后,肝脏病理提示肝细胞体积增大,窦道淤血,出现广泛的坏死。与Notch1^(FL/FL)对照组相比,Notch1^(M-KO)小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)明显升高,血清炎性因子水平上升,HE染色显示肝细胞体积增大更明显,伴大面积坏死及炎性细胞浸润,DCF探针检测显示原代肝细胞内ROS增加。肝组织p-TAK1表达增加,Casp-8的表达减少,RIPK1、p-MLKL表达增加。结论:在AILI中,髓系特异性Notch1敲除可活化TAK1,降低Casp-8水平,激活RIPK1-MLKL坏死性凋亡通路,加重肝损伤的发生。 展开更多
关键词 对乙酰氨基酚 肝损伤 髓系特异性敲除 NOTCH1 TAK1 坏死性凋亡
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