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大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造
被引量：
1
1
作者
黄建华
王晓姣
+2 位作者
魏照辉
张震宇
孙付保
《食品与发酵工业》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第1期7-11,共5页
对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法...
对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。
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关键词
重组大肠杆菌
易错PCR
顺式-3-羟脯氨酸
(cis
-
3
-
hydroxyproline
H
3
P)
脯氨酸
-
3
-
羟化酶
定向改造
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职称材料
产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化
2
作者
姚雪娜
张震宇
+3 位作者
孙付保
陈昶
黄建华
沈松
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第3期243-251,共9页
顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptr...
顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。
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关键词
脯氨酸
-
3
-
羟化酶
顺式-3-羟脯氨酸
密码子优化
重组菌构建
发酵优化
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职称材料
题名
大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造
被引量：
1
1
作者
黄建华
王晓姣
魏照辉
张震宇
孙付保
机构
江南大学工业生物技术教育部重点实验室糖化学与生物技术教育部重点实验室
出处
《食品与发酵工业》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第1期7-11,共5页
基金
国家自然科学基金(30970058)
国家自然科学基金(21176106)
江苏省自然科学基金(BK2012554)
文摘
对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。
关键词
重组大肠杆菌
易错PCR
顺式-3-羟脯氨酸
(cis
-
3
-
hydroxyproline
H
3
P)
脯氨酸
-
3
-
羟化酶
定向改造
Keywords
recombinant Escherichia coli
error
-
prone PCR
cis
-
3
-
hydroxyproline （H
3
P）
proline
-
3
-
hydroxylase
directed evolution
分类号
TQ925 [轻工技术与工程—发酵工程]
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职称材料
题名
产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化
2
作者
姚雪娜
张震宇
孙付保
陈昶
黄建华
沈松
机构
江南大学生物工程学院
江南大学工业生物技术教育部重点实验室
江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室
出处
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第3期243-251,共9页
基金
国家自然科学基金项目(30800018
30970058)
+2 种基金
江苏省自然科学基金项目(BK2012554)
高等学校博士学科点专项科研基金项目(200802951036)
工业生物技术教育部重点实验室主任基金项目(KLIB-ZR200801)
文摘
顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。
关键词
脯氨酸
-
3
-
羟化酶
顺式-3-羟脯氨酸
密码子优化
重组菌构建
发酵优化
Keywords
proline
-
3
-
hydroxylase,cis
-
3
-
hydroxyproline, codon optimization,construction of recombinant Escherichia coli, fermentation optimize
分类号
TQ920.1 [轻工技术与工程—发酵工程]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造
黄建华
王晓姣
魏照辉
张震宇
孙付保
《食品与发酵工业》
CAS
CSCD
北大核心
2017
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化
姚雪娜
张震宇
孙付保
陈昶
黄建华
沈松
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017
0
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职称材料
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