基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

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作者 王帅 邓木兰 +6 位作者 梁志成 周泓宇 何少媚 张智 穆云萍 李芳红 赵子建 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2024年第9期124-130,共7页

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后... 基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L.lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_(8)为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900 ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L.lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养缺陷型标记构建的L.lactis食品级表达载体的方法切实可行,可为推动L.lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。 展开更多

关键词 pyrF 乳酸乳球菌 食品级表达载体 筛选标记 绿色荧光蛋白

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乳酸乳球菌食品级表达载体的改造 被引量：4

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作者 马超 王丕武 +2 位作者 付永平 张卓 刘宏禹 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第19期10247-10250,共4页

[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列... [目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 乳酸乳球菌 SPusp45 食品级载体 分泌性表达 GUS

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Wun1启动子Me13'非转录区的克隆及Hrp基因植物表达载体的构建 被引量：4

3

作者 向云 王蒂 张金文 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2004年第2期124-130,共7页

采用PCR技术,分别从马铃薯、金花菊基因组DNA中扩增到了马铃薯损伤诱导启动子Wun 1,和对启动子活性有显著增强作用的Me1 3 非转录区。经序列同源性分析表明,马铃薯损伤诱导启动子Wun 1与已知序列的同源性为96.86 %,Me1 3 非转录区的同... 采用PCR技术,分别从马铃薯、金花菊基因组DNA中扩增到了马铃薯损伤诱导启动子Wun 1,和对启动子活性有显著增强作用的Me1 3 非转录区。经序列同源性分析表明,马铃薯损伤诱导启动子Wun 1与已知序列的同源性为96.86 %,Me1 3 非转录区的同源性达99 %。得到的Wun 1克隆与原序列有一定的差异,尤其在735～768处差异较大,为一新颖的启动子,现已注册到分子生物学GenBank数据库(GenBank, gi: AY485646)。利用来自欧文氏梨火疫病菌的Hrp基因与克隆的Wun 1启动子和Me1 3 非转录区构建了Wun 1-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI WHM,同时构建了CaMV 35S-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI HM,为下一步鉴定Wun 1启动子和Me1 3 增强子对Hrp基因表达活性的影响及通过遗传转化培育植物抗病品种奠定了基础。 展开更多

关键词 Wun 1启动子 ME1 3′非转录区 HRP基因 植物表达载体

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食品级乳酸菌基因表达系统的研究进展

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作者 唐平 杨亚洲 +1 位作者 刘冠卉 郭锡杰 《中国食物与营养》 2008年第12期28-30,共3页

本文从乳酸基因工程菌、载体选择标记和表达系统的构建方面介绍食品级乳酸菌表达系统,以及乳酸菌基因表达系统的应用前景。

关键词 乳酸菌 食品级 基因工程 表达系统

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乳酸菌基因表达载体及其应用研究进展 被引量：21

5

作者 崔月倩 王菁蕊 王艳萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第9期224-229,共6页

近年来随着乳酸菌的功能特性和应用研究的深入,利用分子手段研究乳酸菌的功能基因已经成为最新研究热点。研究者构建众多不同特性的基因表达载体,本文从载体使用的安全性角度对已经报道的载体进行总结,并介绍各类基因表达载体在发酵产... 近年来随着乳酸菌的功能特性和应用研究的深入,利用分子手段研究乳酸菌的功能基因已经成为最新研究热点。研究者构建众多不同特性的基因表达载体,本文从载体使用的安全性角度对已经报道的载体进行总结,并介绍各类基因表达载体在发酵产胞外多糖、酶制剂、疫苗制备等方面的应用。 展开更多

关键词 乳酸菌 非食品级基因表达载体 食品级基因表达载体 应用

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植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究 被引量：3

6

作者 任大勇 李昌 +3 位作者 秦艳青 杜寿文 诸晴丽 金宁一 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第9期135-139,共5页

以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表... 以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。 展开更多

关键词 Α-半乳糖苷酶 melA基因 食品级筛选标记 穿梭表达载体 乳酸乳球菌

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普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体 被引量：5

7

作者 王静云 窦柏蕊 +1 位作者 包永明 李森武 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1757-1764,共8页

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI,分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI.利用1H NMR、FTIR、粒度仪、Zeta电位仪、透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞... 通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI,分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI.利用1H NMR、FTIR、粒度仪、Zeta电位仪、透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果证明,载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA,并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明,载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7,HeLa和COS-7的毒性低于PEI;当N/P为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela细胞并表达,最佳转染效率及荧光素酶活分别为[(36.67±0.25)%和(28.73±7.19)×108RLU/mg蛋白,RLU为光强度],比Lipo 2000[(49.13±0.61)%,(58.47±7.62)×108 RLU/mg蛋白)略低.因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体. 展开更多

关键词 普鲁兰多糖 聚乙烯亚胺 绿色荧光蛋白表达质粒pGFP 非病毒基因载体

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食品级乳酸菌表达系统的研究进展 被引量：11

8

作者 王莹 胡桂学 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第7期80-83,共4页

乳酸菌以其安全、操作简单等优点被广泛用于表达外源基因,在食品、农业及医药工程领域,具有广阔的应用前景,开发了一系列乳酸菌食品级基因表达系统。目前已建立了糖诱导表达系统、噬菌体φ31暴发式诱导表达系统、乳链球菌素调控表达系... 乳酸菌以其安全、操作简单等优点被广泛用于表达外源基因,在食品、农业及医药工程领域,具有广阔的应用前景,开发了一系列乳酸菌食品级基因表达系统。目前已建立了糖诱导表达系统、噬菌体φ31暴发式诱导表达系统、乳链球菌素调控表达系统、温控表达系统等。随着基因工程技术的发展,以重组乳酸菌作为基因工程菌的时代将要到来。 展开更多

关键词 乳酸菌 食品级 表达系统 基因工程

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原子转移自由基聚合(ATRP)阳离子化菊粉作为非病毒基因载体的研究 被引量：1

9

作者 王静云 付雪 包永明 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2014年第10期2124-2130,共7页

利用原子转移自由基聚合(ATRP)将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯[P(DMAEMA)]偶联到菊粉多糖(Inulin)上,合成了新型基因载体PDIN.利用核磁共振仪、动态光散射分析仪、透射电子显微镜和凝胶电泳对PDIN及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝... 利用原子转移自由基聚合(ATRP)将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯[P(DMAEMA)]偶联到菊粉多糖(Inulin)上,合成了新型基因载体PDIN.利用核磁共振仪、动态光散射分析仪、透射电子显微镜和凝胶电泳对PDIN及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果表明,PDIN可以通过静电相互作用稳定结合pDNA.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、溶血实验、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及β半乳糖苷酶表达质粒(pβgal)转染实验结果表明,PDIN对MCF-7,Hela,COS7和HepG2细胞的毒性较小;其溶血率低,具有良好的血液相容性;载体PDIN能有效将pGFP和pβgal带入COS7细胞并表达,在N/P为1时转染效率最高,其β半乳糖苷酶的酶活为(3.36±0.74)U/mg蛋白,比Lipo2000转染效率[(4.33±0.77)U/mg蛋白]略低.因此,所合成的载体PDIN是一种有潜在应用价值的非病毒基因载体. 展开更多

关键词 菊粉多糖 原子转移自由基聚合(ATRP) 绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP) β半乳糖苷酶表达质粒(pβgal) 非病毒基因载体

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TGEV和PEDV融合S蛋白在乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达与免疫原性分析

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作者 徐波 熊维娜 +3 位作者 周通 刘志文 应碧 郭晓燕 《中国饲料》 北大核心 2014年第4期34-37,共4页

本研究以乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体pRNA48为基础,构建了含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)融合S基因的表达质粒pRNA48-TPs和重组菌L.lactis NZ9000/pRNA48-TPs。SDS-PAGE分析nisin诱导后重组菌表达的... 本研究以乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体pRNA48为基础,构建了含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)融合S基因的表达质粒pRNA48-TPs和重组菌L.lactis NZ9000/pRNA48-TPs。SDS-PAGE分析nisin诱导后重组菌表达的细胞内目的蛋白,然后分别对兔子进行注射免疫和口服免疫,并用Western Blot进行免疫原性分析,结果表明,重组菌细胞内表达的TPs融合蛋白具有较好的免疫原性,注射免疫产生的抗体能特异性识别胞内TPs融合蛋白,同时发现口服免疫也能产生特异的抗体血清,初步证明重组蛋白具有黏膜免疫原性。 展开更多

关键词 TGEV和PEDV融合S蛋白 乳酸乳球菌 食品级载体 细胞内高效诱导表达 免疫原性分析

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棉花抗草甘膦基因表达载体的构建及其初步验证 被引量：6

11

作者 楚宗艳 王坤波 +2 位作者 宋国立 刘方 黎绍惠 《中国棉花》 北大核心 2008年第6期21-22,共2页

关键词 抗草甘膦 基因表达载体 广谱灭生性除草剂 验证 棉花 转基因作物 非选择性 应用

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转基因食品中外源基因非预期效应的分子检测技术 被引量：5

12

作者 徐茂军 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2004年第8期78-82,共5页

转基因食品中外源基因的非预期效应可以引起转基因食品的营养成分含量发生变化 ,甚至产生一些新的毒性物质 ,是转基因植物食品安全性评价的重要内容之一。由于外源基因非预期效应的不可预见性 ,因此用常规的分析技术难以准确测定。利用... 转基因食品中外源基因的非预期效应可以引起转基因食品的营养成分含量发生变化 ,甚至产生一些新的毒性物质 ,是转基因植物食品安全性评价的重要内容之一。由于外源基因非预期效应的不可预见性 ,因此用常规的分析技术难以准确测定。利用蛋白质组定量分析技术和基因芯片技术从蛋白质组和mRNA水平上比较转基因植物食品和非转基因植物食品的基因表达差异 ,是检测外源基因非预期效应的有效手段。文中对利用蛋白质组分析技术和基因芯片技术检测转基因食品中外源基因非预期效应的应用进展进行了综述分析。 展开更多

关键词 基因芯片技术 中外 外源基因 转基因食品 含量 MRNA水平 基因表达差异 预期效应 非转基因 分子检测技术

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大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达 被引量：4

13

作者 马红丹 张丽媛 +4 位作者 赵邯郸 徐丹丹 曲静 关淑艳 王丕武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第1期135-139,共5页

为使大豆锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,Mn SOD)在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的Mn SOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒p NZ8149和经改造的质粒p NZS上,表达载体p NZ-SOD和分泌表达载体p NZS-SOD,将两者分别以电穿孔法... 为使大豆锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,Mn SOD)在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的Mn SOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒p NZ8149和经改造的质粒p NZS上,表达载体p NZ-SOD和分泌表达载体p NZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L.lactis NZ3900/p NZ-SOD和L.lactis NZ3900/p NZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和酶活性对比分析。结果显示:L.lactis NZ3900/p NZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L.lactis NZ3900/p NZ-SOD菌株的1.6倍,是L.lactis NZ3900/p NZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L.lactis NZ3900/p NZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。 展开更多

关键词 锰超氧化物歧化酶(Mn SOD) 食品级分泌表达载体 乳酸乳球菌

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SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对A549细胞生物学行为的影响 被引量：2

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作者 孙硕文 朱之燕 +2 位作者 杜玮 王豪 刘喆 《山东医药》 CAS 北大核心 2015年第22期12-15,共4页

目的探讨SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对人非小细胞肺癌A549细胞SIRT1基因表达、黏附能力、迁移能力及E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表达量的影响。方法构建SIRT1-shRNA慢病毒表达载体,并用其转染A549细胞。对照组转染277空载体... 目的探讨SIRT1-shRNA慢病毒表达载体转染对人非小细胞肺癌A549细胞SIRT1基因表达、黏附能力、迁移能力及E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表达量的影响。方法构建SIRT1-shRNA慢病毒表达载体,并用其转染A549细胞。对照组转染277空载体,观察组转染277-i SIRT1。用RT-PCR法检测两组细胞SIRT1 mRNA表达,用细胞黏附实验检测两组细胞黏附能力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR法检测细胞内E-cadherin、β-catenin mRNA表达,Western blot法检测细胞内E-cadherin、β-catenin蛋白表达。结果观察组、对照组A549细胞SIRT1 mRNA分别为0.48±0.26、1.00±0.00(P<0.05),黏附细胞数分别为(196.6±9.8)、(125.6±9.8)个(P<0.05),细胞相对迁移率分别为65%±2%、100%±0(P<0.05),E-cadherin蛋白表达量分别为1.27±0.16、1.00±0.00(P<0.05),β-catenin蛋白表达量分别为1.24±0.13、1.00±0.00(P<0.05)。结论 SIRT1-shRNA慢病毒表达载体可明显下调A549细胞SIRT1表达,提高其下游基因E-cadherin、β-catenin mRNA和蛋白表达量,增强细胞黏附能力,降低细胞迁移能力。 展开更多

关键词 非小细胞肺癌 SIRT1-shRNA慢病毒表达载体 SIRT1基因 E-CADHERIN蛋白 Β-CATENIN蛋白 细胞黏附 细胞迁移

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磁感应纳米基因靶向治疗方法的研究与展望 被引量：2

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作者 王晓文 唐劲天 《中国微创外科杂志》 CSCD 2009年第6期509-511,523,共4页

关键词 磁性纳米颗粒 肿瘤基因治疗 治疗方法 磁感应 靶向 非病毒载体 热诱导 基因表达

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