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新冠非结构蛋白nsp9细胞定位及其与宿主蛋白互作分析
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作者 张倡珲 代玉涵 +2 位作者 王应归 王美林 赵一洋 《陕西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期94-101,共8页
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)对人类健康及社会经济结构造成了深远且严重的冲击,剖析该病毒复制机制的核心环节对制定有效的SARS-CoV-2防控策略尤为重要。新冠非结构蛋白nsp9是一种关键单链核酸结合蛋白,在病毒生命循环中... 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)对人类健康及社会经济结构造成了深远且严重的冲击,剖析该病毒复制机制的核心环节对制定有效的SARS-CoV-2防控策略尤为重要。新冠非结构蛋白nsp9是一种关键单链核酸结合蛋白,在病毒生命循环中扮演着举足轻重的角色。通过在细胞中过表达融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的nsp9,再利用激光共聚焦显微镜观察发现,nsp9主要定位于细胞核。采用免疫沉淀联合质谱分析初步鉴定出nsp9与包括YWHAB、TRAF2在内的多个细胞内蛋白存在相互作用,并利用免疫共沉淀及pull-down实验进行了验证。此外,通过CCK8细胞活力检测、EdU细胞增殖实验以及TUNEL细胞凋亡实验等方式探究nsp9对宿主细胞生物学特性的潜在影响,发现nsp9过表达并不能显著影响细胞正常增殖或诱导细胞凋亡。研究结果为后续深入探究nsp9与宿主蛋白的互作关系及其在SARS-CoV-2感染中的分子机制提供了一定参考。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 结构蛋白 nsp9 互作蛋白
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生物信息学和分子对接分析HuNoVs非结构蛋白NS3
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作者 王道 肖亚梅 刘丹 《微生物学杂志》 北大核心 2025年第1期85-95,共11页
为了深入探究人类诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)的NS3非结构蛋白的结构特征和小分子药物,运用多种生物信息学方法ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NCBI Conserved Domains、SOPMA、SWISS-MODEL、YinOYang 1.2、Net... 为了深入探究人类诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)的NS3非结构蛋白的结构特征和小分子药物,运用多种生物信息学方法ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NCBI Conserved Domains、SOPMA、SWISS-MODEL、YinOYang 1.2、NetPhos 3.1、ABCpred、SYFPEITHI、Prankweb和Discovery Studio等预测NS3蛋白的同源性、理化性质、翻译后修饰位点、二级/三级结构、B/T细胞抗原表位、活性口袋位点及抑制化合物。HuNoVs的NS3蛋白是由363个氨基酸组成的稳定亲水性蛋白,相对分子量为39748.79 Da,理论等电点为6.37;NS3蛋白与其他病毒解旋酶序列相似性为32.52%,无信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,具有2个功能结构域,38个O-糖基化位点和21个磷酸化位点,7个B-细胞抗原表位和19个T-细胞抗原表位;还存在6个活性口袋位置和5个潜在的小分子抑制化合物。本文为阐明人类诺如病毒非结构蛋白NS3的结构和在病毒性肠胃炎中的作用机制提供了理论依据,也为研发和筛选新疫苗和药物奠定了基础。 展开更多
关键词 人类诺如病毒 结构蛋白NS3 生物信息学 分子对接
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口蹄疫病毒结构蛋白和非结构蛋白调控宿主先天免疫的研究进展
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作者 周敏 汤德元 +6 位作者 曾智勇 王彬 黄涛 胡雯雯 毛茵茗 周飘 何松 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期434-442,共9页
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病,主要感染偶蹄类哺乳动物,包括牛、猪和70多种野生动物[1],临床症状包括发烧、跛行,口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹等[2]。FMD的病原体为口蹄疫病毒(Foota... 口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病,主要感染偶蹄类哺乳动物,包括牛、猪和70多种野生动物[1],临床症状包括发烧、跛行,口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹等[2]。FMD的病原体为口蹄疫病毒(Footand-mouth disease virus,FMDV),其为微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的一种无囊膜的单股正链RNA病毒。 展开更多
关键词 宿主 口蹄疫病毒 结构蛋白 先天免疫 FMDV
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赤羽病病毒非结构蛋白的作用及其机制
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作者 黄俊杰 张苗苗 +7 位作者 赵登率 李平 张远航 赵孟孟 覃丽梅 陈胜锋 高寒 张克山 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第5期97-103,共7页
赤羽病毒也称阿卡斑病毒(AKAV),主要引起以牛羊流产、早产、死胎、新生胎儿发生关节弯曲-积水性无脑综合征(A-H syndrome)为特征的病毒性传染病,其非结构蛋白NSs和NSm在病毒的复制、致病性和免疫逃逸中发挥关键作用。本文综述了非结构蛋... 赤羽病毒也称阿卡斑病毒(AKAV),主要引起以牛羊流产、早产、死胎、新生胎儿发生关节弯曲-积水性无脑综合征(A-H syndrome)为特征的病毒性传染病,其非结构蛋白NSs和NSm在病毒的复制、致病性和免疫逃逸中发挥关键作用。本文综述了非结构蛋白NSs和NSm在AKAV中的功能和特点,对AKAV复制和进化的影响,以及引发的宿主细胞免疫反应,以期为深入了解AKAV非结构蛋白的致病机制,设计有效疫苗和免疫防控治疗策略提供参考。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 结构蛋白 功能 免疫逃逸 病毒复制
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PRRSV非结构蛋白Nsp1α合成肽多克隆抗体的制备及应用
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作者 解艺璇 张彦兵 +10 位作者 李慧 朱琳 葛菲菲 刘珂 魏建超 李宗杰 邵东华 李蓓蓓 马志永 孙延鸣 邱亚峰 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期19-26,共8页
本研究尝试利用PRRSV Nsp1α合成肽进行多克隆抗体的制备,并对抗体的特性进行了分析。首先,利用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp1α的抗原肽序列;随后,按照此序列合成获得抗原肽,并将其与KLH载体蛋白进行偶联;接下来,将偶联... 本研究尝试利用PRRSV Nsp1α合成肽进行多克隆抗体的制备,并对抗体的特性进行了分析。首先,利用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp1α的抗原肽序列;随后,按照此序列合成获得抗原肽,并将其与KLH载体蛋白进行偶联;接下来,将偶联好的抗原肽与弗氏佐剂混合,通过免疫大白兔制备针对Nsp1α合成肽的多克隆抗体;最后,利用ELISA、Western blot及间接免疫荧光法对多克隆抗体的特性进行了分析。结果显示:该多克隆抗体ELISA的效价超过105;利用Western blot可以检测到特异的Nsp1α表达条带,包括瞬时转染的样品和不同毒株病毒感染的样品;利用间接免疫荧光法分析,该多克隆抗体可有效地区分病毒感染和未感染的样品。结果表明,PRRSV Nsp1α合成肽多克隆抗体可以有效地应用于PRRSV Nsp1α表达检测,为进一步研究PRRSV Nsp1α的功能提供了一个有效的工具。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 合成肽 多克隆抗体 结构蛋白
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猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究
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作者 李鑫悦 徐维律 +7 位作者 吕倩 傅心雨 石玉华 李丹月 何苏慧 董露 陈楠 师福山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期731-739,共9页
为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂... 为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 结构蛋白15 核酸内切酶 细胞焦亡 GSDMD
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鸭坦布苏病毒非结构蛋白亚细胞定位及其在IFN-β信号通路中的作用
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作者 张蓉蓉 潘爱銮 +6 位作者 吴娟 方兵兵 汪最 卢琴 张腾飞 温国元 罗青平 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5470-5478,共9页
【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白的亚细胞定位及其在β-干扰素(IFN-β)信号通路中的作用。【方法】通过RT-PCR法扩增DTMUV的7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)基因,将其克隆至真核... 【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白的亚细胞定位及其在β-干扰素(IFN-β)信号通路中的作用。【方法】通过RT-PCR法扩增DTMUV的7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS-HA,构建重组真核表达质粒,并分别转染至HEK-293T细胞,通过Western blotting检测蛋白表达;利用间接免疫荧光试验检测非结构蛋白的亚细胞定位情况,通过双荧光素酶报告试验研究DTMUV的非结构蛋白对鸭源IFN-β启动子活性的影响。【结果】试验成功构建DTMUV的7个非结构蛋白带HA标签的真核表达质粒。Western blotting结果显示,真核表达非结构蛋白均正常表达,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白分子质量大小分别为38、25、14.4、68、13.9、28和100 ku。间接免疫荧光试验结果显示,7个非结构蛋白在细胞内的表达形态不一,主要定位在细胞浆中。双荧光素酶报告试验结果表明,与对照组相比,过表达NS2B和NS4B蛋白后,鸭源IFN-β启动子活性极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了DTMUV的7个非结构蛋白的真核表达质粒,非结构蛋白主要表达于细胞浆中,其中NS2B和NS4B蛋白具有颉颃IFN-β活性的功能。试验结果为DTMUV的免疫逃逸研究提供了一定的理论依据,并为深入探究DTMUV在宿主天然免疫信号通路中的作用机制提供了试验材料。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 结构蛋白 亚细胞定位 IFN-β信号通路
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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析 被引量:4
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作者 温贵兰 张涵淞 +5 位作者 扈鸿霞 章先 张毅 王晓杜 李肖梁 方维焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1109-1116,共8页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 结构蛋白nsp2 表达与剪切方式
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达 被引量:5
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作者 沈张奇 郭鑫 +3 位作者 杨汉春 盖新娜 陈艳红 查振林 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第10期3-5,共3页
通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组... 通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 结构蛋白 nsp9基因 克隆 原核表达
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SARS冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性 被引量:1
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作者 杨星星 邢雅玲 +1 位作者 陈晓娟 陈忠斌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1061-1069,共9页
SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变... SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性.实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15(DeISGylation)活性.研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro.但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性.SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础. 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 结构蛋白质3(nsp3) 去泛素化酶(DUB) 干扰素刺激基因15 (ISGl5) SUMO
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究 被引量:4
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作者 刘惠莉 方莹 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期89-94,共6页
为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGF... 为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145~168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 结构蛋白4(nsp4) 核定位
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp11结构与功能 被引量:2
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作者 姜楠 靳换 +2 位作者 李逸 陈艳红 周磊 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第8期59-62,共4页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害生猪养殖的重要病原,以引起感染母猪繁殖障碍和各日龄猪只呼吸道症状为特征。PRRSV病原具有免疫抑制、持续性感染和高度变异的特性,其在靶细胞(PAMs)中或体内的增殖能力能够直接影响病... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害生猪养殖的重要病原,以引起感染母猪繁殖障碍和各日龄猪只呼吸道症状为特征。PRRSV病原具有免疫抑制、持续性感染和高度变异的特性,其在靶细胞(PAMs)中或体内的增殖能力能够直接影响病毒的致病性,而病毒编码的非结构蛋白(nsp)往往与病毒复制增殖能力密切相关。 展开更多
关键词 结构蛋白 nsp11 病毒 母猪繁殖障碍 致病性 持续性感染 核糖核酸内切酶 免疫抑制 靶细胞 综合征
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传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定 被引量:1
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作者 耿阳 牟小东 +3 位作者 刘然 边葶苈 廖敏 周继勇 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第2期11-16,共6页
本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞... 本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 结构蛋白5 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
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非变性质谱和紫外激光解离在蛋白质结构和相互作用分析中的应用
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作者 薛洁滢 刘哲益 王方军 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期681-692,共12页
蛋白质结构及相互作用的动态变化与其生物学功能密切相关,对蛋白质结构及相互作用进行精准探测和分析面临着巨大挑战。非变性质谱(nMS)是一种能够在近生理条件下将蛋白质及其复合物通过电喷雾离子化引入气相离子并进行质谱分析的方法。... 蛋白质结构及相互作用的动态变化与其生物学功能密切相关,对蛋白质结构及相互作用进行精准探测和分析面临着巨大挑战。非变性质谱(nMS)是一种能够在近生理条件下将蛋白质及其复合物通过电喷雾离子化引入气相离子并进行质谱分析的方法。通过直接测定溶液中蛋白质及其复合物的组成或整合多种质谱解离技术,nMS可获取蛋白质及其复合物的计量关系、组装形式、解离常数、构象变化、结合界面及作用位点等关键信息,以揭示蛋白质相互作用与生物学功能之间的关系。紫外激光解离(UVPD)技术,特别是采用了193 nm准分子激光的UVPD是近年来迅速发展起来的质谱解离技术,其可以高效解离非变性蛋白质骨架,并保留碎片离子中的氢键等非共价相互作用力,从而实现单氨基酸位点分辨的蛋白质动态结构和相互作用质谱解析。本综述主要介绍了nMS和UVPD技术在蛋白质动态结构和相互作用分析中的应用和最新进展,包括由位点突变及配体结合等引起的蛋白质动态结构和相互作用变化,最后对蛋白质nMS表征的未来发展方向做出了展望。 展开更多
关键词 变性质谱 紫外激光解离 蛋白结构 蛋白质相互作用 综述
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小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定
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作者 李菊 毕冬琳 +5 位作者 杨晓莉 杨东亮 张潇文 刘方程 李琼毅 柏家林 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第5期1047-1054,共8页
为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与... 为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 结构蛋白C 杂交瘤细胞技术 单克隆抗体
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乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用
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作者 郝悦 徐胜奎 阮文科 《北京农学院学报》 2024年第1期37-42,共6页
【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,... 【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。 展开更多
关键词 乙型脑炎 结构蛋白 hnRNP K 免疫共沉淀 蛋白互作
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猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测 被引量:3
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作者 司朝朝 史西保 +7 位作者 李恭贺 乔松林 王丽 李青梅 王超 陈静 王寅彪 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2015年第1期126-129,共4页
为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆... 为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 结构蛋白 重组蛋白 免疫学活性
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发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白的表达和定位及宿主互作蛋白的筛选和分析
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作者 骆丽可 程子文 +3 位作者 程廓 李永刚 王大为 杨宝玲 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1286-1296,共11页
目的:通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)非结构蛋白(NSs)的宿主互相作用(互作)蛋白,探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径,为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法:将真核表达载体pS... 目的:通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)非结构蛋白(NSs)的宿主互相作用(互作)蛋白,探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径,为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法:将真核表达载体pSFTSV-NSs-Flag (实验组)和Flag-CMV-3 (阴性组)分别转染进人胚胎肾293T细胞中,同时设置空白组(不进行任何处理)。收集各组细胞裂解液,采用间接免疫荧光和Western blotting法验证SFTSV NSs在宿主细胞中的表达及定位。蛋白裂解液经protein A/G处理,采用免疫沉淀法富集与NSs结合的宿主蛋白,通过银染和考马斯亮蓝染色初步分析捕获的互作蛋白,观察各组蛋白差异条带。采用液相色谱和串联质谱技术得到蛋白质的序列信息,保留可信蛋白基于UniProt数据库检索,对鉴定到的蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、蛋白结构域和功能位点数据库(IPR)、真核生物同源蛋白簇(KOGs)功能注释、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析、亚细胞定位和转录因子(TF)功能注释,确定互作蛋白的亚细胞结构、基因功能及参与的生物过程。结果:SFTSV NSs在相对分子质量33 000处表达单一特异性条带,免疫荧光检测其定位于细胞质中,且聚集呈砂粒体包涵体样。银染和考马斯亮蓝染色,实验组和阴性组均存在显著差异条带。质谱筛选出46种潜在互作蛋白;GO功能富集分析、KOGs功能注释和KEGG信号通路富集分析,与病毒翻译、细胞代谢及蛋白质运输相关的生物途径富集到较多数目的蛋白,注释中有8种蛋白具有中间丝蛋白结构域。亚细胞定位所占百分率最高的是细胞质蛋白;与NSs定位场所一致。TF功能注释,有1种蛋白来自NF-Y家族。结论:互作蛋白在协助蛋白质正确折叠、参与核糖体翻译和构成细胞骨架等进程中发挥作用,可能参与了抗病毒复制,可作为候选蛋白进一步研究SFTSV的复制机制。 展开更多
关键词 发热伴血小板减少综合征病毒 结构蛋白 蛋白-蛋白互相作用 免疫沉淀 质谱
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冠状病毒非结构蛋白Nsp2的演化、结构与功能
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作者 薛甜 焦亚娟 黄耀伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1375-1382,共8页
以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经... 以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经切割后形成的成熟加工产物。Nsp2的研究较少,其在病毒复制相关的生命周期、与宿主相互作用等过程中发挥的主要作用至今未得到阐明。尽管Nsp2在不同CoVs中变异程度较大,但其演化分型与不同冠状病毒亚属的分型一致。最近对SARS-CoV-2 Nsp2的高级结构进行了解析和分析,同时也发现了SARS-CoV-2 Nsp2上存在一些与新冠突变株相关的显著突变,但是对Nsp2结构与突变及其生物学功能的联系仍不清楚。虽然Nsp2对于冠状病毒复制是非必须的,但是对于野生毒株达到最大病毒复制量至关重要。Nsp2被招募到被感染细胞的双层膜囊泡结构,与多种病毒蛋白质相互作用,协同参与病毒复制与转录。Nsp2还通过与多种宿主蛋白质相互作用,不仅参与线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的生理过程,调节宿主细胞的能量代谢与物质转运,还通过影响干扰素的产生调节宿主先天免疫应答。本文对冠状病毒,特别是新冠病毒的Nsp2的产生、遗传演化、结构、主要变异位点进行了归纳,同时对其参与病毒复制、与病毒蛋白质及宿主蛋白质互作等最新研究进行概述总结,以期为冠状病毒的病原生物学、致病机制研究与防控提供参考。 展开更多
关键词 冠状病毒 新冠病毒 结构蛋白2 演化 结构 生物学功能
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新型冠状病毒非结构蛋白NSP13通过调控IκBα蛋白降解抑制NF-κB信号通路
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作者 闫聪睿 安华英 +10 位作者 马骏 巩家媛 高锋华 宁畅文 张猛 李宝义 苏允琦 魏汉琪 刘鹏宇 蒋兴伟 于群 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2023年第4期256-262,共7页
目的研究新型冠状病毒非结构蛋白13(NSP13)调控NF-κB信号通路的作用机制。方法利用GV367-NSP13-FLAG慢病毒感染的方法制备高表达NSP13的A549细胞(A549-NSP13)和A549对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测NF-κB下游细胞因子白... 目的研究新型冠状病毒非结构蛋白13(NSP13)调控NF-κB信号通路的作用机制。方法利用GV367-NSP13-FLAG慢病毒感染的方法制备高表达NSP13的A549细胞(A549-NSP13)和A549对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测NF-κB下游细胞因子白细胞介素6(IL-6)和趋化因子5(CCL-5)表达水平;Western印迹法检测NF-κB信号通路P65、磷酸化P65和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白表达。放线菌酮10 mg·L^(-1)处理细胞0,15,30,45,90和120 min,Western印迹法检测IκBα蛋白半衰期。结果与A549对照组相比,A549-NSP13细胞检测到FLAG标签蛋白条带,且NSP13 mRNA表达显著上调(P<0.01),表明A549-NSP13细胞系构建成功。与A549对照组相比,A549-NSP13细胞IL-6 mRNA和蛋白表达水平(P<0.01)及CCL-5 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)均显著降低;磷酸化P65蛋白表达下降(P<0.01),而IκBα蛋白表达上调(P<0.01);且IκBα蛋白半衰期增加(P<0.01)。结论NSP13蛋白可通过抑制IκBα降解进而抑制NF-κB信号通路的活化并降低其下游IL-6和CCL-5等炎症相关分子产生和分泌。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 结构蛋白13 NF-ΚB信号通路 NF-κB抑制因子α蛋白
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