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非洲猪瘟病毒编码蛋白功能及疫苗研究进展 被引量：8
1
作者 安一娜 杨静静 +1 位作者 高敏 董彦君 《养殖与饲料》 2021年第10期107-114,共8页
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)感染引起的急性、高致死性、高度接触传染性猪类疾病,被世界动物卫生组织列为法定需要报告的动物疫病,我国也将其列为一类动物传染性疾病。自1921年首发... 非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)感染引起的急性、高致死性、高度接触传染性猪类疾病,被世界动物卫生组织列为法定需要报告的动物疫病,我国也将其列为一类动物传染性疾病。自1921年首发于非洲,ASF给疫情暴发国带来了巨大的经济损失。然而,ASFV基因组巨大、编码蛋白众多、大量蛋白功能尚不清楚,这严重制约了疫苗的研发。2018年ASFV传入中国,促使政府对非洲猪瘟研究投入加大,推进了相关的研究。近期通过查阅ASFV基因文库,发现ASFV编码的蛋白有159种,其中已知功能的有91种,预测功能的有9种,未知功能的有59种。因此,本文对非洲猪瘟病毒编码蛋白功能及疫苗研究进展进行了更新,为揭示ASFV致病机制及ASF疫苗开发提供相关信息。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 非洲猪瘟病毒编码蛋白 蛋白功能 感染过程 非洲猪瘟疫苗
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非洲猪瘟病毒编码蛋白H240R稳定了正常的病毒粒子形态结构 被引量：8
2
作者 ZHOU PING-PING LI LIAN-FENG ZHANG KE- HUI 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期111-111,共1页
非洲猪瘟(ASF)是严重危害全球养猪业的一种烈性传染病,目前尚无疫苗可用。该病的病原,非洲猪瘟病毒(ASFV),是一种核质大DNA病毒。虽然感染性ASFV颗粒的结构蛋白已经被解析,但大多数病毒结构蛋白的定位及其功能仍然未知。ASFV编码一个主... 非洲猪瘟(ASF)是严重危害全球养猪业的一种烈性传染病,目前尚无疫苗可用。该病的病原,非洲猪瘟病毒(ASFV),是一种核质大DNA病毒。虽然感染性ASFV颗粒的结构蛋白已经被解析,但大多数病毒结构蛋白的定位及其功能仍然未知。ASFV编码一个主要的衣壳蛋白p72和多个小的衣壳蛋白M1249L、p17和p49。已有文献表明,缺失p72和p17的ASFV不能进行衣壳的组装,缺失pB438L的ASFV产生了异常形态的病毒粒子且不具有感染性,而H240R在ASFV复制周期中的功能是未知的。 展开更多
关键词 烈性传染病 非洲猪瘟病毒 病毒结构蛋白 衣壳蛋白 DNA病毒 养猪业 病毒粒子 复制周期
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：2
3
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒D205R蛋白单克隆抗体的制备和抗原表位鉴定
4
作者 林志钊 赵燕燕 +6 位作者 任豪杰 史赛燕 韩世充 何文瑞 万博 张雨杭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期124-130,共7页
非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表... 非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示,成功构建pET32a-D205R表达质粒,并纯化大小约为44 ku的重组D205R蛋白。蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果表明,重组D205R蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应,有良好的免疫原性。利用杂交瘤细胞融合、筛选的方法,得到mAb 19A5。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明,mAb 19A5能特异性识别真核表达的重组D205R蛋白,并能检测到野生型D205R蛋白。用丙氨酸扫描法鉴定出167-SDPPVVWLGGRPGD-180是mAb 19A5的抗原表位,S167、W173、L174、G175、P178和D180是与mAb19A5结合的关键氨基酸。保守性和结构分析表明,抗原表位高度保守,且位于蛋白质表面,是线性表位。综上,成功制备mAb 19A5,并鉴定了mAb 19A5识别的抗原表位。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D205R蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价
5
作者 张越 茹毅 +7 位作者 郝荣增 杨锐 赵陇和 李亚军 杨洋 张荣 蒋成辉 郑海学 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1344-1354,共11页
本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化... 本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化后经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞,分离小鼠血清测定特异性抗体滴度,利用Western blot和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量,将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质,有跨膜区,无信号肽,蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot显示IPTG诱导后,成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化,刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128000,能与ASFV-GFP病毒特异性结合,与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白,免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化,引起细胞因子水平升高,制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制,具有较好的免疫原性,为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) H108R蛋白 多克隆抗体 免疫原性
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非洲猪瘟病毒结构蛋白与宿主蛋白相互作用研究进展
6
作者 张素 孙丽芳 +3 位作者 李兰兰 吴琳娇 陈磊清 吴允昆 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期95-106,共12页
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达... 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染所引起的一种家猪和各种野猪急性出血的传染性疾病,由于高发病率和高致死性的特性对全球家猪养殖产业造成严重的经济损失。ASFV编码蛋白高达150多种,而ASFV结构蛋白作为病毒粒子的主要组成部分,在协助病毒吸附入侵宿主细胞、促进子代病毒颗粒复制、组装以及释放等过程发挥着重要作用。研究表明,病毒结构蛋白可通过与宿主蛋白的相互作用,促进病毒入侵、增殖、影响病毒毒力以及拮抗宿主免疫反应等。因此,本文通过概述ASFV结构蛋白与宿主蛋白的相互作用及其机制,为研究ASFV的致病机制以及ASF的防治提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 结构蛋白 宿主蛋白 蛋白相互作用
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非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析
7
作者 周俊明 倪艳秀 +5 位作者 范宝超 祝昊丹 朱雪蛟 王丹丹 胡屹屹 李彬 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1875-1881,共7页
为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,... 为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后,获得p30蛋白氨基酸序列中8~101 aa片段(P-1#)、58~101 aa片段(P-2#)、101~158 aa片段(P-3#)、8~194 aa片段(P-4#),用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示,上述片段均获得诱导表达及纯化,表达形式有可溶性表达(P-1#、P-3#)和包涵体表达(P-2#、P-4#)。各片段以1.0 mg/L包被时,p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应,ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳,与P-3#反应中等,与P-2#反应最弱。综上,p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据,这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 氨基酸序列片段 反应原性
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半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体
8
作者 刘蓓蓓 韦艳娜 +7 位作者 陈蓉 谢星 倪博 郝飞 张珍珍 白昀 袁厅 冯志新 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期682-689,共8页
为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规... 为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pA104蛋白 单克隆抗体 半固体培养法
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表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定 被引量：3
9
作者 张梦雨 叶昱 +11 位作者 何后军 黄玉婷 江宁 邓佳丽 曾紫怡 应若嫣 余巧 唐玉新 宋德平 丁珍 樊惠英 黄冬艳 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期419-426,共8页
【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒p... 【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组猪痘病毒 活疫苗载体 p72蛋白
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非洲猪瘟病毒增殖过程中主要蛋白研究进展 被引量：2
10
作者 赵旭阳 樊帅 +7 位作者 靳家鑫 张帅 路闻龙 朱潇静 王芮 张改平 孙爱军 庄国庆 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期228-236,共9页
非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪引起的非洲猪瘟(ASF),是一种急性、烈性、高度接触性传染病,给世界养猪业带来巨大经济损失。ASFV编码超过150种蛋白,广泛参与病毒的进入、复制和形态发生等过程。ASFV主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细... 非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪引起的非洲猪瘟(ASF),是一种急性、烈性、高度接触性传染病,给世界养猪业带来巨大经济损失。ASFV编码超过150种蛋白,广泛参与病毒的进入、复制和形态发生等过程。ASFV主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞,在细胞质中核周微管组织中心(MTOC)处的“病毒工厂”中完成复制和装配,并通过微管转运至细胞膜,以“出芽”的方式释放到细胞外。本文重点分析了参与病毒进入、复制、组装和释放过程的关键蛋白功能,初步探讨其潜在研究价值,为进一步的ASF疫苗和药物靶点研发提供支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 增殖过程 病毒蛋白 疫苗
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非洲猪瘟病毒pE248R蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：1
11
作者 杜楠楠 陈金霞 +6 位作者 曹云雷 张宽 童武 李丽薇 赵冉 童光志 高飞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期188-194,共7页
本研究利用PCR方法从非洲猪瘟病毒的灭活样品中扩增出747 bp的E248R基因全长序列,利用同源重组法构建原核表达质粒pCold I-pE248R,经1 mmol/L的IPTG诱导1 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析,表达蛋白的分子量约为32... 本研究利用PCR方法从非洲猪瘟病毒的灭活样品中扩增出747 bp的E248R基因全长序列,利用同源重组法构建原核表达质粒pCold I-pE248R,经1 mmol/L的IPTG诱导1 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析,表达蛋白的分子量约为32 kDa,利用纯化后得到pE248R重组蛋白作为免疫原经过4次免疫后制备鼠源抗pE248R多克隆抗体。利用该多克隆抗体检测实验室构建并拯救的已证明能够稳定表达ASFV pE248R蛋白的重组病毒rPRRSV-E248R,结果显示制备的抗pE248R的多克隆抗体能够与rPRRSV-E248R发生特异性结合反应,证明利用本试验中原核表达的pE248R蛋白制备的多克隆抗体具有抗pE248R蛋白的特异性,为进一步针对ASFV E248R基因建立快速,特异性的血清学检测方法奠定了基础,也为针对pE248R蛋白的功能性研究提供了研究基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 E248R基因 pE248R蛋白 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制 被引量：1
12
作者 闫文倩 侯景 +12 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 史喜绢 张大俊 别鑫恬 陈国辉 陈玲玲 何路 赵美玉 赵思越 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期854-859,共6页
旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析 被引量：1
13
作者 李艳蕊 任静 +6 位作者 崔锦蔷 袁晨 王云霄 马亚娟 刘志昌 李永社 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1660-1670,共11页
【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) CD2v蛋白 胞外域 胞内域 蛋白表达 抗原性
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非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立 被引量：1
14
作者 王程 夏应菊 +1 位作者 王海东 刘业兵 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4440-4449,共10页
【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P... 【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 间接ELISA方法 P54蛋白 原核表达
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非洲猪瘟病毒入胞过程相关蛋白及分子机制的研究进展 被引量：1
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作者 宋新宇 夏应菊 刘业兵 《中国兽药杂志》 2024年第6期79-85,共7页
非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟的病原,可引发家猪和野猪急性、出血性死亡,目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物。ASFV是囊膜病毒,其囊膜蛋白的结构和功能可能是影响病毒入侵和细胞嗜性的重要因素。病毒入胞是病毒感染细胞的第一步,通常是通... 非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟的病原,可引发家猪和野猪急性、出血性死亡,目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物。ASFV是囊膜病毒,其囊膜蛋白的结构和功能可能是影响病毒入侵和细胞嗜性的重要因素。病毒入胞是病毒感染细胞的第一步,通常是通过细胞表面特定的分子与病毒蛋白相结合吸附于宿主细胞表面,以ASFV入胞过程的病毒蛋白或宿主因子为靶点或可有效抑制ASFV的复制。从ASFV入胞过程中起重要作用的囊膜蛋白出发,了解ASFV的入胞分子机制,为ASFV入胞深入研究以及治疗性药物和疫苗的研发提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 囊膜蛋白 病毒入胞 分子机制
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非洲猪瘟病毒pE120R蛋白单克隆抗体的制备
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作者 刘传霞 王晓 +5 位作者 李雪雯 鲍苗菲 李婷婷 陈欣 翁长江 郑君 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期388-394,共7页
本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE... 本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE120R蛋白,采用GST Beads纯化pE120R蛋白,免疫BALB/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选获得了1株能够稳定分泌pE120R单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R,并获得较高纯度的pE120R蛋白。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果显示,pE120R单抗能特异性识别HEK293T细胞转染质粒表达的Flag-pE120R蛋白和肺泡巨噬细胞(PAMs)感染ASFV后表达的pE120R蛋白。该单抗的结合位点在30~60aa区域,并且该单抗亚类鉴定重链为IgG2a。本研究成功表达并纯化了可溶性的pE120R蛋白;制备了抗pE120R的单抗隆抗体,该抗体具有良好的特异性,为深入探讨ASFV pE120R蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pE120R蛋白 原核表达 单抗隆抗体
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非洲猪瘟病毒B602L蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备
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作者 郭晨云 宋金星 +5 位作者 王梦翔 孙俊如 闫若潜 谢彩华 吴亚楠 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3980-3989,共10页
【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。... 【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。特异性抗体对于抗非洲猪瘟免疫应答机制及血清学检测方法研究具有重要意义,本研究旨在获取ASFV B602L蛋白,并制备抗ASFV B602L蛋白的多克隆抗体,为ASFV B602L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】以ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的B 602 L基因为研究对象,应用生物信息学软件对B602L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、抗原性和蛋白结构进行分析后,利用同源重组的方法将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得B602L重组蛋白,利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting对B602L蛋白纯化效果进行验证。将纯化后的B602L蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和Dot blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析表明,B602L蛋白属于稳定性亲水蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(54.91%)、延伸链(9.81%)和无规则卷曲(32.08%)。成功构建了ASFV B602L重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组菌pET-28a-B602L-BL21在16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导下高效表达,获得的重组蛋白主要表达在BL21菌株上清中,大小约为70 ku,且能与ASFV阳性血清特异性结合。间接ELISA检测结果显示,制备的抗B602L鼠源多克隆抗体效价达1∶409600,Western blotting和Dot blotting试验结果表明,抗B602L鼠源多克隆抗体能够特异性识别B602L蛋白。【结论】原核表达的B602L重组蛋白具有良好的免疫原性,能够与ASFV阳性血清特异性结合,制备的鼠抗ASFV B602L蛋白多克隆抗体具备较好的生物学活性。本试验结果可为进一步研究ASFV B602L蛋白的生物学功能和非洲猪瘟诊断方法的建立提供生物材料和理论支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) B602L蛋白 原核表达 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 王晓 刘传霞 +5 位作者 鲍苗菲 李雪雯 李婷婷 陈欣 郑君 翁长江 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期176-181,共6页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了重组原核表达质粒pET-21a-p34,将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE以及Western blot鉴定,结果显示,得到了可溶性表达的His-p34重组蛋白。将纯化的蛋白免疫小鼠,然后通过细胞融合以及ELISA筛选,获得了1株能够稳定分泌p34蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经Western blot鉴定,该抗体能够特异性识别通过转染质粒过表达的外源p34蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)表达的内源p34蛋白;免疫荧光试验表明,外源转染以及内源表达的p34蛋白均能被特异性标记;免疫沉淀(IP)试验结果显示,该单克隆抗体能够特异性的结合HEK293T细胞中外源表达的p34蛋白以及ASFV感染PAMs中内源表达的p34蛋白。综上所述,本研究成功制备了p34蛋白的单克隆抗体,该抗体可以用于内源性p34蛋白的鉴定,为该蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p34蛋白 原核表达 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒蛋白结构及疫苗研究进展
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作者 王红帅 谢水华 +3 位作者 刘建营 郭建超 李亮 陈迎丰 《养殖与饲料》 2024年第4期71-77,共7页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的1种高致死性传染病。自ASF疫情暴发以来,ASF对全球养猪业造成巨大损失。ASFV是由许多蛋白质组成的复杂结构,这些蛋白的功能和作用机制研究尚不清楚,以及复杂的免疫逃逸机制,使得疫苗开发极具... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的1种高致死性传染病。自ASF疫情暴发以来,ASF对全球养猪业造成巨大损失。ASFV是由许多蛋白质组成的复杂结构,这些蛋白的功能和作用机制研究尚不清楚,以及复杂的免疫逃逸机制,使得疫苗开发极具困难。为此,解析ASFV蛋白的结构和功能将有助于更清楚地了解病毒与宿主之间的相互作用,以及ASFV的复制和传播机制,有助于筛选保护性抗原,并设计更有针对性和更有效的ASF疫苗。本文总结了近年来ASFV蛋白结构功能和疫苗开发方面的研究进展和突破,以期为科学防控非洲猪瘟提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 蛋白结构 ASF疫苗
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非洲猪瘟病毒p54蛋白的高效表达及在ELISA中的应用 被引量：11
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作者 龚振华 王丽萍 +9 位作者 臧京帅 张康 刘春菊 吴晓东 张启迪 秦晓冰 陈琳琳 单虎 王树双 王志亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1832-1837,共6页
本研究旨在高效原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白,并进一步将其用于ELISA试验研究。参考非洲猪瘟病毒Con09/Bzz020株P54基因(E183L)的核苷酸序列,通过序列优化后合成P54基因,克隆至表达载体pET-30c(+),构建重组质粒pET-30c(+)-p54。... 本研究旨在高效原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白,并进一步将其用于ELISA试验研究。参考非洲猪瘟病毒Con09/Bzz020株P54基因(E183L)的核苷酸序列,通过序列优化后合成P54基因,克隆至表达载体pET-30c(+),构建重组质粒pET-30c(+)-p54。结果显示,pET-30c(+)-p54有完整的阅读框架,可高效表达分子量约20.7ku的p54蛋白,该蛋白表达稳定,具有可溶性,易于纯化,纯度高达900μg·mL-1,所表达的p54蛋白的氨基酸序列与Con09/Bzz020株p54蛋白氨基酸序列相同;Western blot试验显示,表达的p54蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性反应;ELISA试验显示,p54蛋白针对ASFV阳性血清和阴性血清的P/N值为4.67。研究结果证实p54蛋白表达产量高,易于纯化,具有较好的抗原性,可用于非洲猪瘟ELISA诊断。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 ELISA
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