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C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响
1
作者
陈亚利
王倩
+4 位作者
刘涵
宗志友
满淑丽
孙媛霞
陈朋
《食品工业科技》
CAS
北大核心
2024年第22期131-140,共10页
为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为...
为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后,构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E.coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达,并对其酶学性质进行了表征。结果表明,ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时,ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg,较TsGP提高1.3倍。在50~65℃的工业酶催化条件下,ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当,且酶活力更高。此外,ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性,最小底物为麦芽三糖,且随着底物链长的增加,比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物,ΔTsGP的kcat值为37.09 s^(−1),比TsGP提高了1.21倍,但底物亲和力(K_(m)=3.30 mmol/L)降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴,并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。
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关键词
嗜热
α-葡聚糖磷酸化酶
葡萄糖-1-磷酸
非催化结构域
蛋白截短
酶学性质
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职称材料
尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较
2
作者
张雷
曹宇亮
刘明华
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期1055-1058,共4页
目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上...
目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上,转入BL21(DE3)中表达,产物经亲和层析纯化。昆明小鼠随机分为催化结构域蛋白免疫组、非催化结构域蛋白免疫组、AaHⅣ免疫组、PBS免疫组,每组6只[4周龄,体质量(20±2)g,雌雄各半],3次免疫后分离血清,与AaHⅣ体外孵育后行出血中和实验。结果 ELISA显示重组表达的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域均具有免疫原性。出血中和实验显示:催化结构域免疫组和非催化结构域免疫组均较PBS免疫组显著减少出血面积(P<0.05);AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异(P>0.05),而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异(P<0.05)。结论 AaHⅣ催化结构域免疫小鼠产生的抗体在中和AaHⅣ出血毒性方面效果更为显著。
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关键词
尖吻蝮蛇
蛇毒金属蛋白酶
SVMPs
催化
结构域
非催化结构域
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职称材料
题名
C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响
1
作者
陈亚利
王倩
刘涵
宗志友
满淑丽
孙媛霞
陈朋
机构
天津科技大学生物工程学院
中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程研究中心
出处
《食品工业科技》
CAS
北大核心
2024年第22期131-140,共10页
基金
国家重点研发计划(2022YFC2104901)
国家自然科学基金(42106124)
天津市合成生物技术创新能力提升行动(TSBICIP-CXRC-077)。
文摘
为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后,构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E.coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达,并对其酶学性质进行了表征。结果表明,ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时,ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg,较TsGP提高1.3倍。在50~65℃的工业酶催化条件下,ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当,且酶活力更高。此外,ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性,最小底物为麦芽三糖,且随着底物链长的增加,比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物,ΔTsGP的kcat值为37.09 s^(−1),比TsGP提高了1.21倍,但底物亲和力(K_(m)=3.30 mmol/L)降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴,并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。
关键词
嗜热
α-葡聚糖磷酸化酶
葡萄糖-1-磷酸
非催化结构域
蛋白截短
酶学性质
Keywords
thermophilic alpha-glucan phosphorylase
glucose-1-phosphate
non-catalytic domain
protein truncation
enzy-matic properties
分类号
Q71 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较
2
作者
张雷
曹宇亮
刘明华
机构
第三军医大学西南医院急救部
出处
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期1055-1058,共4页
基金
国家自然科学基金面上项目(81071537)
重庆市科技攻关计划(CSTC20105026)
第三军医大学临床科研课题(2009XLC15)~~
文摘
目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上,转入BL21(DE3)中表达,产物经亲和层析纯化。昆明小鼠随机分为催化结构域蛋白免疫组、非催化结构域蛋白免疫组、AaHⅣ免疫组、PBS免疫组,每组6只[4周龄,体质量(20±2)g,雌雄各半],3次免疫后分离血清,与AaHⅣ体外孵育后行出血中和实验。结果 ELISA显示重组表达的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域均具有免疫原性。出血中和实验显示:催化结构域免疫组和非催化结构域免疫组均较PBS免疫组显著减少出血面积(P<0.05);AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异(P>0.05),而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异(P<0.05)。结论 AaHⅣ催化结构域免疫小鼠产生的抗体在中和AaHⅣ出血毒性方面效果更为显著。
关键词
尖吻蝮蛇
蛇毒金属蛋白酶
SVMPs
催化
结构域
非催化结构域
Keywords
Agkistrodon acutus
snake venom metalloproteinase
SVMPs
catalytic domains
non-cat-alytic domains
分类号
R345 [医药卫生—基础医学]
R392.13 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响
陈亚利
王倩
刘涵
宗志友
满淑丽
孙媛霞
陈朋
《食品工业科技》
CAS
北大核心
2024
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较
张雷
曹宇亮
刘明华
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014
0
在线阅读
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职称材料
已选择
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