弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应 被引量：3

1

作者 丛华 古钦民 +5 位作者 江渊 周怀瑜 何深一 杨婷婷 李瑛 赵群力 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期338-341,共4页

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 ... 目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。 展开更多

关键词 弓形虫 SAG1/SAG2 霍乱毒素a2/b亚基 DNA免疫

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用含霍乱毒素A_2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30 被引量：1

2

作者 于瑾 古钦民 +6 位作者 李瑛 何深一 王伟 卞继峰 周怀瑜 赵群力 丛华 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第6期21-23,16,共4页

目的　克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2 /B亚基基因的原核表达载体 ,为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法　应用PCR方法扩增出P30基因片段后 ,克隆入含有霍乱毒素A2 /B亚基基因的表达质粒pUAB0 2 4 ,在大肠杆菌JM10 9(DE3)中表... 目的　克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2 /B亚基基因的原核表达载体 ,为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法　应用PCR方法扩增出P30基因片段后 ,克隆入含有霍乱毒素A2 /B亚基基因的表达质粒pUAB0 2 4 ,在大肠杆菌JM10 9(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS -PAGE电泳及Westernblotting进行检测鉴定。 结果　电泳证明质粒构建正确 ,SDS -PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带 ,Westernblotting进一步证实该条带为P30 -CTA2 /B融合蛋白。结论　表达载体pUAB0 2 4 -P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30 -CTA2 B。 展开更多

关键词 霍乱毒素 a2/b 载体 大肠杆菌 弓形虫 表面抗原P30 弓形虫病 基因表达

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乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

3

作者 石成华 曹诚 +1 位作者 张京生 马清钧 《生物化学杂志》 CSCD 1994年第5期533-538,共6页

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因，与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达，表达量达３０μｇ／ｍＬ，表达产物９５％以上... 通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因，与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达，表达量达３０μｇ／ｍＬ，表达产物９５％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合，说明融合蛋白保持了霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）的基本高级结构和生物学功能；酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性；应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品，为研究融合蛋白免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。 展开更多

关键词 霍乱毒素b亚基 乙型肝炎病毒 抗原决定簇 肽苗

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霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统的构建 被引量：1

4

作者 曹诚 石成华 +1 位作者 张京生 马清钧 《生物化学杂志》 CSCD 1994年第5期579-583,共5页

霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变，在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ，构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同，... 霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变，在ＣＴＢ基因（ｃｔｘＢ）３′端终止密码前引入了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ，构建了质粒ｐＭＣ０５。ｐＭＣ０５中ＣＴＢ与下游ｌａｃＺ′基因阅读框架相同，转化大肠杆菌后能够表达ＣＴＢ与β－半乳糖苷酶α肽的融合蛋白；所表达的融合蛋白能与ＧＭ１结合，说明融合蛋白保持ＣＴＢ的基本高级结构和生物学活性；融合蛋白能与抗－ＣＴＢ抗体结合，说明融合蛋白具有ＣＴＢ的抗原性。以上结果表明：通过将外源抗原决定簇基因融合至ｃｔｘＢ的３′端，在大肠杆菌中表达融合蛋白，构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响，构建了高效表达融合蛋白的载体－宿主系统。 展开更多

关键词 霍乱毒素b亚基 基因融合 肽苗

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肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺样毒素2B亚基的表达 被引量：1

5

作者 丁益强 王长军 俞守义 《医学研究生学报》 CAS 2008年第6期587-590,I0003,共5页

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接... 目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌0157:H7 志贺样毒素2b亚基 克隆表达

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霍乱毒素B亚基对胡萝卜的遗传转化

6

作者 陈书霞 方荣祥 +2 位作者 刘玲 程智慧 李霞 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2003年第5期43-46,共4页

　以胡萝卜无菌幼苗的下胚轴为外植体,通过携带CTB基因的根癌农杆菌的介导进行转化,在Kan50mg/L和Carb500mg/L的MS3-1固体培养基上诱导形成胚性愈伤组织,转至Kan100mg/L和Carb100mg/L的MS0固体培养基上形成植株,同时还进行了以经过预处... 　以胡萝卜无菌幼苗的下胚轴为外植体,通过携带CTB基因的根癌农杆菌的介导进行转化,在Kan50mg/L和Carb500mg/L的MS3-1固体培养基上诱导形成胚性愈伤组织,转至Kan100mg/L和Carb100mg/L的MS0固体培养基上形成植株,同时还进行了以经过预处理的下胚轴为外植体进行转化的试验,发现低温处理4d的下胚轴的抗性愈伤诱导率较高。经PCR检测、PCR-Southern杂交检测以后,表明CTB基因已整合进胡萝卜的基因组中。RT-PCR检测初步证明了CTB基因的转录。 展开更多

关键词 霍乱毒素b亚基 胡萝卜 遗传转化 下胚轴 外植体 根癌农杆菌 固体培养基 胚性愈伤组织

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大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达 被引量：1

7

作者 郑峰 周志江 刘建青 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第2期115-118,共4页

目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,... 目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,连接到表达载体pET-28a以构建重组质粒。将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,通过IPTG诱导进行表达,对表达蛋白进行SDSPAGE电泳分析和Western检测。结果用PCR方法扩增出了预期大小的VT2B亚基基因,克隆得到重组质粒pET28aVT2B,转化后宿主菌成功表达分子量为8kD的目的蛋白,用特异抗体经Western检测该条带为阳性反应。结论目的基因成功克隆到宿主菌内,目的蛋白得到高效表达,最佳诱导时间为4h,目的蛋白表达量可达总蛋白量45.72%。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157 志贺毒素2 b亚基 克隆与表达

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甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究 被引量：1

8

作者 杨晓芳 江滟 +4 位作者 李婉宜 邝玉 蒋忠华 王丰平 李明远 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期263-266,共4页

目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)... 目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)中,再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB。用KEGEN TRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RT-PCR产物序列分析、Western blot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 M2e 黏膜免疫佐剂 霍乱毒素b亚单位 融合蛋白

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大肠杆菌脂蛋白与CTB-pres2抗原基因的融合及表达 被引量：6

9

作者 林旭 石成华 +3 位作者 曹诚 李平 包幼迪 马清钧 《生物化学杂志》 CSCD 1997年第3期276-281,共6页

首次采用基因融合方式，在乱毒素B亚基-乙型肝炎病毒Pres2抗原融合基因（ctxB-Pres2）的5’端了引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及N端九个氨基酸的核苷酸序列，分别置于ctb及lpp／lac启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达．表达的融合蛋白... 首次采用基因融合方式，在乱毒素B亚基-乙型肝炎病毒Pres2抗原融合基因（ctxB-Pres2）的5’端了引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及N端九个氨基酸的核苷酸序列，分别置于ctb及lpp／lac启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达．表达的融合蛋白均定位于膜上，并且可以和GM1、抗-CTB抗体及抗HBVPreS2单克隆抗体结合，说明该融合蛋白保留了CTB的基本高级结构及CTB、PreS2抗原的抗原性．3H-棕榈酸标记实验证实该融合蛋白发生脂肪化，为免疫原性研究奠定了基础．此外，还研究了不同信号肽和宿主菌对该蛋白表达的影响． 展开更多

关键词 脂蛋白 霍乱毒素b亚基 乙型肝炎病毒 基因融合

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融合型原肌球蛋白MBP-CTB-TM构建及其口服致敏性评价

10

作者 傅玲琳 黄健健 +2 位作者 谢梦华 王翀 王彦波 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第20期114-121,共8页

将麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)、霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit,CTB)以及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因重组构建MBP-CTB-EGFP并原核表达纯化,利用HEK293T细胞模型探究MBP... 将麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)、霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit,CTB)以及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因重组构建MBP-CTB-EGFP并原核表达纯化,利用HEK293T细胞模型探究MBP-CTB-EGFP穿透细胞膜的能力,从而开发新型黏膜佐剂.进一步地,利用原肌球蛋白(tropomyosin,TM)重组融合蛋白MBP-CTB-TM,将其应用于Balb/c小鼠致敏实验,探究融合蛋白的致敏性及其对小鼠食物过敏相关免疫反应的影响,以达到降低过敏原剂量提高建模效率的效果.结果表明:MBP-CTB-EGFP具有作为黏膜佐剂的能力,从而促进外源蛋白进入HEK293T细胞内,且与转染方式相比,携带外源蛋白进入细胞的效率更高.另一方面,利用融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠,TM特异性IgE的OD450 nm达到0.4,而天然TM致敏组仅为0.05,此外融合蛋白致敏还导致高水平的TM特异性IgG1、IgG2a产生.本研究表明,融合蛋白MBP-CTB-TM致敏效果更好,有可能达到降低过敏原用量的效果,为后续食物过敏研究提供了有力工具. 展开更多

关键词 霍乱毒素b亚基 原肌球蛋白 融合蛋白 食物过敏 小鼠模型

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抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析 被引量：1

11

作者 张俊毅 陈敏达 +3 位作者 涂追 许杨 邓建中 李燕萍 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第21期224-229,共6页

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体p ET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对... 利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体p ET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC_(50))为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。 展开更多

关键词 赭曲霉毒素a 纳米抗体 霍乱毒素b亚基 原核表达

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