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鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA检测方法的建立
1
作者 胡骁飞 邢云瑞 +3 位作者 邢广旭 孙亚宁 王琳 张改平 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第10期2495-2498,2504,共5页
目的:建立高灵敏度的鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA(icELISA)检测方法。方法:基于已获得的利巴韦林单克隆抗体,采用棋盘试验确定抗原抗体最佳工作浓度,从而建立icELISA方法,并对该方法的性能进行鉴定。结果:建立的icELISA方法线性范围为0... 目的:建立高灵敏度的鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA(icELISA)检测方法。方法:基于已获得的利巴韦林单克隆抗体,采用棋盘试验确定抗原抗体最佳工作浓度,从而建立icELISA方法,并对该方法的性能进行鉴定。结果:建立的icELISA方法线性范围为0.44~32.71 ng/ml,IC50为3.78 ng/ml,最低检测限(LOD)为0.20 ng/ml;除了与利巴韦林特异反应外,与其他抗病毒药物均无交叉反应;样品加标回收率为91.60%~100.76%,变异系数7.29%~10.63%。结论:本研究建立了灵敏度高、特异性强的利巴韦林icELISA检测方法,可用于检测鸡肉中利巴韦林残留。 展开更多
关键词 利巴韦林 抗病毒药物 鸡肉 检测 间接竞争elisa
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接elisa方法 抗体检测 净化
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鸭短喙矮小综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用
3
作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《福建农业学报》 北大核心 2025年第7期649-655,共7页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一种高特异性的间接ELISA检测方法,用于鸭短喙矮小综合征病毒(SBDSV)血清抗体的定性分析。【结果】建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度0.1 mg·mL^(−1),37℃孵育2 h后再4℃过夜包被;1%BSA 37℃封闭2 h;血清样本1∶200稀释;阴阳性临界值为0.3214。该检测方法特异性好,与其他常见水禽病毒阳性血清均无交叉反应;敏感性高,阳性高免血清(LPAI效价2^(8))1∶204800倍稀释时检测结果仍为阳性;批内、批间重复性好,变异系数均小于6%;利用所建立的ELISA方法对70份SBDSV疑似感染病鸭的血清样品进行检测,检测结果与LPAI检测结果符合率为90%。对福建省648份临床送检1日龄雏鸭血清样品进行检测,抗体阳性率约为48.30%,显示福建省养鸭场存在不同程度的SBDSV感染。【结论】本研究建立的SBDSV血清抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性高,适合大规模血清学检测,可为监测SBDSV在我国的流行情况以及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭短喙矮小综合征 间接elisa 抗体检测
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
4
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接elisa
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新城疫病毒HN蛋白的截短表达及间接ELISA方法建立
5
作者 魏玲 王思怡 +4 位作者 熊荣园 梁洪 王怀禹 李彩虹 杨国淋 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第3期91-95,共5页
为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表... 为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,间接ELISA方法检测6种其它鸡病阳性血清均为阴性,其最低抗体检出效价为1∶10240,其与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)方法的阳性和阴性符合率分别为98.08%和92.31%,检测临床样品阳性率为91.48%。说明建立的间接ELISA方法可用于NDV免疫抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN蛋白 截短表达 间接elisa 抗体检测
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
6
作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接elisa(ielisa) 原核表达
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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4
7
作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) VP6蛋白 截短表达 间接elisa
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动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断方法的建立 被引量：1
8
作者 庄勇 向蒙 +6 位作者 冯桂丹 杨显超 夏炉明 肖文轩 张蒙 王建 张鹭 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期125-133,共9页
本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动... 本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断的方法。该方法适用于实验室样品批量检测,其敏感性为0.912,特异性为0.949。应用本研究建立的动物结核分枝杆菌间接ELISA法和商品化动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒共检测犬、猫、野生动物、SPF实验动物血清共552份。其中间接ELISA方法共检出6份血清抗体阳性,阳性检出率为1.09%(6/552);商品化夹心法试剂盒共检出8份血清抗体阳性,阳性检出率为1.45%(8/552);两者之间阳性重合数为6份,阳性重合率为85.72%(6/7);阴性重合数为544份,阴性重合率为99.82%(544/545)。结果表明,两种诊断方法的检测结果具有较高的一致性。本方法的建立,与国外商品化试剂盒比较,不但有望实现这类检测产品的国产替代,同时实现了一种方法对不同物种来源血清的快速检测。 展开更多
关键词 抗原 结核分枝杆菌复合群 ECX 间接elisa
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基于Stefin抗原兔豆状囊尾蚴病间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
9
作者 王由森 石正发 +6 位作者 车亮 张月玥 羊倩倩 李甲 肖琴 孙晓林 王泽祥 《甘肃农业大学学报》 北大核心 2025年第1期1-9,共9页
【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包... 【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包被条件、封闭条件、血清稀释度、酶标二抗稀释度、反应时间、温度等条件,以阳性血清与阴性血清的D_(450 nm)比值(P/N)作为判断标准优化反应条件,并对ELISA方法的敏感性、特异性、重复性进行检测。【结果】测定了重组蛋白浓度。间接ELISA检测方法临界值为0.352。阳性血清稀释倍数至1∶12800时,D_(450 nm)的值仍大于临界值。兔球虫、兔弓形虫等阳性血清检测显示D_(450 nm)均小于0.352。【结论】Stefin蛋白可以大批量获得,以stefin作为抗原建立的间接ELISA检测方法可以应用于豆状囊尾蚴病的诊断和流行病学调查研究,对豆状囊尾蚴病的有效防控具有重要的意义。 展开更多
关键词 豆状囊尾蚴 BRADFORD 间接elisa Stefin
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基于副结核分枝杆菌重组MAP0827c蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用 被引量：1
10
作者 俞杰 许淑芸 +3 位作者 魏京京 魏增科 赵昌乐 周霞 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第3期271-277,共7页
为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c... 为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c,并经酶切和测序鉴定正确后利用原核表达系统表达重组MAP0827c蛋白,以该蛋白作为包被抗原,采用棋盘滴定法筛选间接ELISA反应条件,确定临界值,以异源阳性血清验证该方法的特异性;通过稀释阳性血清评估所建方法的灵敏性;以5份牛MAP阳性血清进行该方法的批内和批间试验评估该方法的重复性。结果显示,MAP0827c蛋白由374个氨基酸构成,含15个抗原决定簇,不存在跨膜区和信号肽,二级结构以α螺旋为主。经原核系统表达了分子量为42 ku的目的蛋白。建立的ELISA方法蛋白最佳包被量为0.05μg/mL,一抗血清最佳稀释倍数为1:100,二抗兔抗牛IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:5000,封闭液选择1%明胶封闭1 h,一抗血清作用时为1 h,酶标二抗孵育时间为1 h,显色时间为25 min;特异性试验结果显示,建立的间接ELISA方法仅对MAP阳性血清检测为阳性,而不与布鲁氏菌、结核分枝杆菌及金黄色葡萄球菌的牛阳性血清发生反应,特异性强;敏感性试验结果显示,可检测的阳性血清最大稀释度为1:800,敏感性高;批内和批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。采用建立的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒对70份临床牛血清样品进行检测,结果显示,二者的阳性检出率分别为30%(21/70)和34.29%(24/70),二者的总符合率为95.71%。本研究首次建立了基于MAP0827c蛋白的检测MAP抗体的间接ELISA方法,为MAP流行病学调查和检测提供了可行技术手段。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 MAP0827c蛋白 原核表达 抗体 间接elisa
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基于鸽鹦鹉热衣原体外膜蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立及应用
11
作者 张紫萱 杨志远 +8 位作者 刘月焕 杨宝琳 高洁 冯倩倩 罗伟珏 林健 赵际成 黄程 胡格 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第10期4920-4929,共10页
【目的】建立一种适用于鸽鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。【方法】试验对Cps的主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)编码基因进行... 【目的】建立一种适用于鸽鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。【方法】试验对Cps的主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)编码基因进行密码子优化,在N-端加入触发因子(trigger factor,TF)后连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-30a-M,经IPTG诱导表达和纯化后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行可溶性分析及鉴定。通过棋盘滴定法选择最佳抗原包被浓度和血清稀释度,优化鸽Cps抗体的间接ELISA法。比较本研究建立的间接ELISA法与间接血凝试验(indirect hemagglutination assay,IHA)的敏感性。通过检测鸽其他常见疾病阳性血清评估该方法的特异性,检测Cps阳性和阴性血清各3份以评估其重复性,并利用253份鸽源血清(174份临床血清样品、79份Cps灭活疫苗免疫后血清样品)评估该间接ELISA法与IHA法的符合率。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,在诱导超声破碎后上清中成功表达大小约100 ku的MOMP蛋白,表明该蛋白具有可溶性。间接ELISA法优化后条件为:2μg/mL抗原4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,血清稀释度为1∶200、血清孵育时间为1 h,辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸽IgY孵育30 min,底物反应时间为10 min。鸽Cps阳性血清稀释度为1∶16时,间接ELISA法检测结果仍为阳性,敏感性高于IHA法。间接ELISA法与其他常见鸽病阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复试验结果显示,间接ELISA法变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性。本研究建立的间接ELISA法和IHA法检测临床样品和免疫后血清样品的符合率分别为80.72%和85.71%,Kappa值分别为0.60和0.69。【结论】本研究建立的间接ELISA法敏感性高、特异性强、重复性好,适用于Cps血清抗体的检测。 展开更多
关键词 鸽 鹦鹉热衣原体 间接elisa 间接血凝试验(IHA) 抗体
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牛结节性皮肤病病毒ORF002蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
12
作者 张亚岭 景伟 +7 位作者 赵妍 何小兵 房永祥 苏洋 李小明 张慧 景志忠 陈国华 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第11期5817-5825,共9页
本研究旨在建立一种基于牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF002蛋白的间接ELISA抗体检测方法。通过构建重组质粒pET-30a(+)-ORF002并诱导表达,获得相对分子质量约为13 ku的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot验证后的ORF002蛋白为包被抗原,建立LSD... 本研究旨在建立一种基于牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF002蛋白的间接ELISA抗体检测方法。通过构建重组质粒pET-30a(+)-ORF002并诱导表达,获得相对分子质量约为13 ku的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot验证后的ORF002蛋白为包被抗原,建立LSDV间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化。优化后的间接ELISA条件为:抗原包被浓度2.5μg·mL^(-1),血清稀释度1∶100,二抗稀释度1∶120000。结果判定标准为待检样品OD_(450 nm)值≥标准阳性值×20.34%为阳性,反之为阴性。重复性试验变异系数<10%,与多种病毒阳性血清无交叉反应。该方法具有良好的敏感性、特异性及重复性,适用于LSD感染临床血清样品检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病 ORF002 原核表达 间接elisa
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猫杯状病毒VP1蛋白B细胞表位的串联表达及间接ELISA方法的建立
13
作者 王真真 汤傲星 +9 位作者 刘春草 李娜 林亮亮 宋若楠 贾楠楠 杜汉宇 朱杰 李传峰 刘光清 孟春春 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期103-109,共7页
为建立一种检测猫杯状病毒抗体的间接ELISA方法,本试验将截短的猫杯状病毒VP1蛋白表达为重组蛋白纯化后作为包被抗原。采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了比较。结果显示,抗... 为建立一种检测猫杯状病毒抗体的间接ELISA方法,本试验将截短的猫杯状病毒VP1蛋白表达为重组蛋白纯化后作为包被抗原。采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了比较。结果显示,抗原包被量为2μg/mL,血清最佳稀释度为1∶1000,37℃作用1 h;二抗的最佳工作浓度为1∶10000;TMB底物显色液37℃避光显色反应15 min。特异性试验结果显示,同FPV和FHV阳性血清均无交叉反应。此方法对猫细小病毒阳性血清的敏感性为1∶40960;组内、组间变异系数均小于5%。与本实验室建立的包被全病毒的方法平行比较,显示其检测阴阳性血清的值高度一致。结果表明,建立的基于截短的猫杯状病毒VP1蛋白建立的间接ELISA方法非常适用于临床样本的检测,可为猫杯状病毒的防控工作提供技术支撑。 展开更多
关键词 猫杯状病毒 VP1蛋白 串联的B细胞表位 间接elisa
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猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
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作者 曾苗苗 杨小曼 +9 位作者 张鑫 刘大凯 时洪艳 张记宇 张燎原 陈建飞 冯廷帅 李修文 石达 冯力 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期319-326,共8页
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用... 为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) N蛋白 原核表达 间接elisa
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基于牛分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10-TB27.4间接ELISA检测方法的建立
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作者 姜美奇 赵文娟 +11 位作者 许淑芸 魏京京 黎雪勤 徐雪可 周霞 吴桐忠 王莉莉 韩猛立 张星星 张倩 钟发钢 黄新 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期480-486,515,共8页
为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温... 为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温度和时间下经IPTG诱导表达并超声破碎。采用镍亲和层析方法纯化重组EC-27.4蛋白(rEC-27.4)后,通过SDS-PAGE检测rEC-27.4的表达及纯化效果,采用western blot检测其反应原性。SDS-PAGE结果显示,当IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为16℃时,诱导rEC-27.4的表达量最高且其以可溶性形式表达,且纯化后在75 ku处出现单一目的条带。Western blot结果显示在75 ku处出现特异性条带。经BCA试剂盒测定rEC-27.4的浓度为0.852 mg/mL。以纯化的该重组蛋白作为包被抗原,采用棋盘法优化各反应条件,初步建立检测MB抗体的间接ELISA方法。采用优化后的间接ELISA方法分别检测MB阳性和阴性血清以及沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏菌和牛病毒性腹泻病毒等阳性牛血清,评估该方法的特异性;将MB阳性血清2倍倍比稀释(1:50~1:6400)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同批次和不同批次表达的rEC-TB27.4分别包被ELISA板,采用优化的间接ELISA方法检测5份MB阳性血清和3份阴性血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能检测到MB阳性血清,其他相关细菌及病毒阳性血清均为阴性结果;牛分枝杆菌阳性血清1:400稀释时仍为阳性结果;该方法对8份血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于7%。采用建立的间接ELISA方法检测377份临床牛血清样品,并同时采用动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒及PPDB皮肤试验(TST)和BTB IFN-γ释放试验(IGRA)检测,结果显示,该间接ELISA方法的阳性检测率为6.90%(26/377),阴性样品数为351份;夹心ELISA试剂盒的阳性检测率为7.43%(28/377),阴性样品数为349份;TST和IGRA的阳性检测率均为52.52%(198/377),阴性样品数均为179份。本研究建立的间接ELISA与夹心ELISA抗体检测试剂盒的阳性和阴性符合率分别为53.6%和96.8%;与TST和IGRA的阳性和阴性符合率均为11.1%和97.8%。本研究基于MB r EC-27.4建立的间接ELISA抗体检测方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,在MB所致牛结核的早期检测中有一定的优势,为牛结核的检测和早期诊断提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 ESAT6-CFP10-TB27.4融合蛋白 原核表达 间接elisa
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伪结核棒状杆菌磷脂酶D蛋白的表达及间接ELISA方法的建立与应用
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作者 白婕妤 孙婧 +5 位作者 黄宇璇 王聚涛 杜金鑫 夏利宁 张万江 李刚 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第8期826-831,共6页
为建立羊伪结核棒状杆菌(Cp)的快速检测方法,本研究经PCR从Cp模式株ATCC19410中扩增磷脂酶D(PLD)编码基因,将其克隆至pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-PLD,经测序鉴定正确的该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后切胶纯化,... 为建立羊伪结核棒状杆菌(Cp)的快速检测方法,本研究经PCR从Cp模式株ATCC19410中扩增磷脂酶D(PLD)编码基因,将其克隆至pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-PLD,经测序鉴定正确的该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后切胶纯化,采用SDS-PAGE检测重组PLD蛋白(rPLD)的表达及纯化效果,经western blot检测其反应原性。结果显示,在37 ku处出现目的条带,且纯化效果好,该蛋白具有较好的反应原性。以纯化的rPLD为包被抗原,采用方阵法优化间接ELISA各反应条件,结果显示最佳抗原包被浓度为每孔100 ng、待检血清最佳稀释倍数为1:50、血清孵育时间为0.5 h、最佳封闭液为2%明胶、封闭时间2 h、兔抗山羊IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:20000、二抗孵育时间1 h、抗体阴阳性临界值为0.432,表明初步建立了检测Cp血清抗体的间接ELISA方法。利用该ELISA方法检测Cp、山羊痘病毒、羊支原体、结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、小反刍兽疫病毒、羊布鲁氏菌的阳性血清,结果显示,除Cp外其余病原的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将Cp阳性血清2倍倍比稀释后利用该ELISA方法检测,结果显示,该方法对阳性血清的检测限为稀释度1:640,该方法敏感性较高。利用5份Cp阳性血清和3份Cp阴性血清进行重复性试验,结果显示,该ELISA方法批内、批间重复性试验的最大变异系数分别为5.53%和7.79%,重复性较好。利用该ELISA方法和菌体凝集抑制试验对50份临床血清样品检测,结果显示,二者的阳性符合率为88.9%,阴性符合率为88.5%,总符合率为88.7%。进一步利用该ELISA方法对451份黑龙江省部分地区羊场的血清样品检测,结果显示,Cp抗体阳性率为51%(230/451),表明黑龙江省部分地区羊场导致羊干酪性淋巴结炎(CLA)的Cp感染率较高。本研究建立的间接ELISA方法为Cp血清抗体的检测提供了候选的技术手段,为Cp感染的早期检测和流行病学研究提供了有力技术支撑。 展开更多
关键词 结核棒状杆菌 磷脂酶D 间接elisa 抗体检测
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弓形虫GRA1蛋白表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 张翩 陈晶 +8 位作者 张晓晓 麦小鹏 唐科 向华 王刚 罗胜军 马惠海 袁子国 王晓虎 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第7期3308-3320,共13页
【目的】通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白,并建立其抗体间接ELISA(iELISA)检测方法,为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-GRA1,利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白,并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化,经Western blottin... 【目的】通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白,并建立其抗体间接ELISA(iELISA)检测方法,为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-GRA1,利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白,并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化,经Western blotting鉴定其免疫原性。以纯化的GRA1蛋白作为抗原包被于固相载体,并用棋盘法确定抗原最佳包被浓度和待测血清稀释度。在此基础上,优化抗原包被条件、封闭条件、待测血清稀释度和酶标二抗稀释度。通过测定阴性血清D450 nm值确定所建立方法的临界值,并进行特异性、敏感性和重复性试验,同时测定该方法与改良凝集试验(MAT)对实际样品检测的符合率。【结果】SDS-PAGE结果显示,GRA1蛋白以可溶性形式表达,蛋白分子质量约为25 ku。Western blotting显示GRA1蛋白与猪弓形虫阳性血清发生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清稀释度为1∶100,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉37℃作用2 h,待检血清作用时间为60 min,酶标二抗稀释度为1∶20000,TMB作用时间为15 min。该检测方法的临界值为0.277。该方法敏感性良好,血清按1∶6400稀释后仍可检测到阳性;批内和批间重复性变异系数均<10%,重复性好;与猪带绦虫、旋毛虫、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。利用该方法和MAT方法对100份临床猪血清进行检测,总符合率为94.0%。【结论】本研究建立了一种快速有效的检测猪弓形虫抗体的间接ELISA方法,有助于猪感染弓形虫病的诊断和预防。 展开更多
关键词 猪 弓形虫 GRA1 原核表达 间接elisa
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体制备与竞争ELISA方法的建立
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作者 何启杰 农作荣 +7 位作者 王豪 牛晨霞 莫勇芳 欧阳康 陈樱 黄伟坚 黄稳妃 韦祖樟 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期23-29,共7页
依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其... 依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其特异性。随后建立竞争ELISA方法,并对实验室收集的2016-2019年广西11个地区64个规模猪场592份猪血清进行SVA抗体检测。结果显示,诱导表达出的重组VP2蛋白主要以可溶性形式表达,血清中VP2抗体效价大于1∶64000,且制备的VP2抗体能特异结合SVA感染细胞中的VP2蛋白。竞争ELISA检测结果显示广西地区猪场SVA血清阳性率高达76.6%,血清样品阳性率高达55.9%,研究结果为SVA的检测和研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡 VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 竞争elisa
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竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究 被引量：11
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作者 赵灿奇 冯宇 +5 位作者 吕浪 李彦军 魏玉磊 丁家波 陈祥 蒋卉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2146-2153,共8页
旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试... 旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。 展开更多
关键词 布鲁氏菌病 竞争酶联免疫吸附试验 间接酶联吸附试验 微量补体结合试验 初筛 确诊
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猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 邵永恒 倪民婷 +6 位作者 高梦玲 汤娇 张耕馨 林圣宇 刘光亮 陈佳宁 王雯慧 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期883-889,共7页
旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该... 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 VP1蛋白 原核表达 间接elisa
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