目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ion...目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ionomycin(1.0μmol/L)建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN933种浓度(0.25、0.5、1.0μmol/L)的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;应用Western blot法检测CaMKⅡ表达的变化。结果①细胞培养至第4天,免疫组织化学染色90%以上细胞α-肌动蛋白抗体阳性。②与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值[(660.16±108.47)vs(376.12±57.57),P<0.01];KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响(P>0.05)。③预先加入3种不同浓度KN93可显著降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度(P<0.01),与对照组比较差异也有统计学意义(P<0.01)。④钙超载组细胞CaMKⅡ表达较对照组明显增加(P<0.01);而KN93对细胞CaMKⅡ表达影响不明显。⑤不同浓度KN93预处理后,钙超载组细胞CaMKⅡ的表达显著降低(P<0.01)。结论 CaMKⅡ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙负荷,并下调细胞CaMKⅡ表达。展开更多
目的:探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion ...目的:探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)在海洛因(heroin,HE)致心肌细胞节律异常中的作用。方法:联合蛋白组学和GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析心律失常芯片数据,寻找关键调控因子。构建IP3R1基因敲减慢病毒并感染原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs),实验分为对照(control)组、HE组和HE+shIP3R1组。结晶紫染色观察心肌细胞形态;ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;透射电镜观察线粒体形态学变化;Fluo-4/AM探针法检测细胞内Ca^(2+)浓度;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;免疫共沉淀(co-immunopre-cipitation,Co-IP)分析IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1蛋白之间的相互作用;Western blot检测IP3R1、CaMKⅡδ、p-CaM-KⅡδ(T287)和VDAC1的蛋白水平。结果:结合蛋白质组学和基因表达谱数据集GSE89410分析,筛选得到80个差异共表达分子,基于基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果,最终筛选出关键因子IP3R1,且通过STRING数据库获得IP3R1结合蛋白:CaMKⅡδ和VDAC1。Co-IP结果验证IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1存在相互作用,且HE干预后NRCMs中IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1之间的相互作用增强。体外细胞实验显示,与control组相比,HE组NRCMs数量急剧减少,细胞膜变窄,伪足减少,细胞核结构模糊;LDH和AST水平均显著上升(P<0.05);线粒体超微结构损伤严重,证实HE对NRCMs具有毒性作用并导致线粒体损伤。与control组相比,HE组心肌细胞内Ca^(2+)浓度、ROS水平、MMP以及IP3R1、p-CaMKⅡδ(T287)和VDAC1蛋白水平均显著升高(P<0.05),而HE+shIP3R1组这些指标均显著减低(P<0.05);ATP水平则相反。这证实沉默IP3R1表达可减轻HE干预后NRCMs的钙超载及线粒体损伤。结论:IP3R1通过调控CaMKⅡ和VDAC1引起心肌细胞钙超载和ROS生成增多,参与HE诱导的心肌细胞节律异常。展开更多
文摘目的观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的表达变化进行检测。方法新生大鼠心房肌细胞原代培养96h,应用钙离子导入剂ionomycin(1.0μmol/L)建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN933种浓度(0.25、0.5、1.0μmol/L)的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;应用Western blot法检测CaMKⅡ表达的变化。结果①细胞培养至第4天,免疫组织化学染色90%以上细胞α-肌动蛋白抗体阳性。②与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值[(660.16±108.47)vs(376.12±57.57),P<0.01];KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响(P>0.05)。③预先加入3种不同浓度KN93可显著降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度(P<0.01),与对照组比较差异也有统计学意义(P<0.01)。④钙超载组细胞CaMKⅡ表达较对照组明显增加(P<0.01);而KN93对细胞CaMKⅡ表达影响不明显。⑤不同浓度KN93预处理后,钙超载组细胞CaMKⅡ的表达显著降低(P<0.01)。结论 CaMKⅡ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙负荷,并下调细胞CaMKⅡ表达。
