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重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建
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作者 刘栋 赵勤 +6 位作者 赵国强 杨洪艳 郑乃刚 金戈 赵继敏 高丽 董子明 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2003年第4期483-485,共3页
目的 :构建含有野生型DNA聚合酶 β基因的重组表达载体VR10 12 polβ。 方法 :提取胎儿食管上皮组织的总RNA ,反转录成cDNA ,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR10 12 ,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果 :插入片段与Ge... 目的 :构建含有野生型DNA聚合酶 β基因的重组表达载体VR10 12 polβ。 方法 :提取胎儿食管上皮组织的总RNA ,反转录成cDNA ,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR10 12 ,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果 :插入片段与GenBank报道一致 ,并且插入方向正确。结论 :重组野生型DNA聚合酶 β表达载体VR10 12 polβ的构建成功 。 展开更多
关键词 重组野生型dna聚合酶β 基因表达 载体 VRl012-polβ
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野生型DNA聚合酶β转染Eca-109细胞后增变基因表型变化 被引量:1
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作者 郑乃刚 高涵昌 +3 位作者 吴景兰 裴迎新 王一菱 董子明 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2008年第6期1085-1090,共6页
目的:探讨野生型DNA聚合酶β(polbeta)转染人食管癌Eca-109细胞后对其增变基因表型的效应。方法:将经过鉴定的重组pcDNA3.1质粒(插入野生型,wt)-polbeta转染培养的人食管癌Eca-109细胞。将Eca-109细胞分为3组:转染实验组(E)、空质粒转... 目的:探讨野生型DNA聚合酶β(polbeta)转染人食管癌Eca-109细胞后对其增变基因表型的效应。方法:将经过鉴定的重组pcDNA3.1质粒(插入野生型,wt)-polbeta转染培养的人食管癌Eca-109细胞。将Eca-109细胞分为3组:转染实验组(E)、空质粒转染对照组(C1)和未转染对照组(C2)。应用原位杂交技术显示wt-polbeta和wt-p53的杂交信号,免疫细胞化学染色显示POLB-免疫反应性(IR)和多药耐受(MDR1)-IR,免疫印迹显示wt-polbeta和突变(mt)-polbeta的带型,细胞化学技术检测各组细胞的增殖与分化细胞的比率。结果:polbeta免疫印迹结果显示E组呈现增强的wt-polbeta主带,C1、C2组呈现很弱wt-polbeta主带和显著突变的(mt)-polbeta主带(P<0.01);polbeta免疫细胞化学结果显示E组的强信号定位于细胞核内,C1、C2组信号皆很弱(P<0.01)。E组的wt-polbeta及wt-p53原位杂交的信号强于C1、C2组(P<0.01)。E组MDR1的免疫反应性和增殖与分化细胞的比率低于C1、C2组(P<0.01)。结论:wt-polbeta转染的Eca-109细胞呈现wt-polbeta及wt-p53表达上调而mt-polbeta及MDR1表达下调的增变基因表型减弱。 展开更多
关键词 野生型dna聚合酶β 转染 dna聚合酶β-p53-MDR1表达亚群 增变基因表型 ECA-109细胞
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人野生型DNA聚合酶β在NIH3T3细胞中的定位
3
作者 赵军 赵勤 +9 位作者 赵国强 秦冰 路静 宋谦 崔自由 赵继敏 杨红艳 黄幼田 汤黎明 董子明 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2005年第4期596-597,共2页
目的:研究人野生型DNA聚合酶β(wtDNApolβ)在NIH3T3细胞内的定位。方法:将携带人wtDNApolβ的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ,用脂质体介导的方法转染NIH3T3细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,观察wtpEGFP-C3-polβ融合基因表... 目的:研究人野生型DNA聚合酶β(wtDNApolβ)在NIH3T3细胞内的定位。方法:将携带人wtDNApolβ的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ,用脂质体介导的方法转染NIH3T3细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,观察wtpEGFP-C3-polβ融合基因表达。以转染空质粒pEGFP-C3的NIH3T3细胞为对照。结果:转染细胞均有GFP表达,说明转染成功。转染pEGFP-C3-polβ的细胞胞核荧光强度较胞浆强,而空质粒转染细胞胞浆胞核荧光强度无差别。结论:wtDNApolβ在NIH3T3细胞中定位于胞核内。 展开更多
关键词 野生型dna聚合酶β 转染 蛋白质定位 NIH3T3细胞
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重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建 被引量:3
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作者 赵国强 刘栋 +5 位作者 赵勤 杨洪艳 金戈 赵继敏 高丽 董子明 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2003年第4期480-483,共4页
目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段... 目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。 展开更多
关键词 重组突变型dna聚合酶β 表达 载体 pcdna3.1-polβ 食管癌
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重组Tgo DNA聚合酶的特性 被引量:2
5
作者 盛艳敏 许月 +2 位作者 廖俊杰 吴英杰 李彦舫 《吉林大学学报(理学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1008-1010,共3页
检测了重组Tgo酶的扩增性能、耐热性以及长距离PCR能力,结果表明,该重组酶扩增性能与Taq酶相当;其耐热性极强,在95℃40 m in,仍具有很强的聚合活性;利用重组酶在常规PCR条件下,成功扩增了5.3 kb的拟南芥Tim eless基因片段.
关键词 重组Tgo dna聚合 扩增性能 耐热性 PCR
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重组TaqDNA聚合酶在大肠杆菌中表达条件的优化 被引量:1
6
作者 何钢 邢伟一 +2 位作者 罗丽华 石慧 韩文军 《中南林学院学报》 CSCD 2004年第4期62-65,共4页
 以插入重组TaqDNA聚合酶基因的pET-24a表达质粒转化大肠杆菌菌株,转化菌铺平板的最佳量为50至100μL,可获得转化菌的单菌落,单菌落扩大到200mL培养量,表达TaqDNA聚合酶,经SDS-PAGE分析,表达带的相对分子质量约为82ku,最佳表达条件为...  以插入重组TaqDNA聚合酶基因的pET-24a表达质粒转化大肠杆菌菌株,转化菌铺平板的最佳量为50至100μL,可获得转化菌的单菌落,单菌落扩大到200mL培养量,表达TaqDNA聚合酶,经SDS-PAGE分析,表达带的相对分子质量约为82ku,最佳表达条件为接种量1/500,工程菌培养到OD600值为1.0开始诱导,以2mmol/LIPTG诱导8h,TaqDNA聚合酶可获得较高的表达效率. 展开更多
关键词 生物化学 重组Taq dna聚合 大肠杆菌 表达条件
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重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化
7
作者 肖云 陈洁 《粮油食品科技》 CAS CSCD 2023年第4期154-161,共8页
Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、... Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。 展开更多
关键词 重组大肠杆菌 Taq dna聚合 比活力 发酵工艺 响应面分析法
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人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建 被引量:2
8
作者 杜柳涛 庄志雄 +4 位作者 高昆 杨杏芬 何云 徐雷 魏青 《中山医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第3期187-189,共3页
【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表... 【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 。 展开更多
关键词 dna聚合酶β 聚合链反应 dna 重组
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DNA聚合酶β可能参与了更广泛的细胞反应并引起遗传不稳定 被引量:5
9
作者 王谷亮 余应年 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期427-432,共6页
The major role of DNA polymerase β was thought to be limited in its involvement in short patch base excision repair by removing 5’-deoxyribose phosphate and base insertion. However, the recent researches indicate th... The major role of DNA polymerase β was thought to be limited in its involvement in short patch base excision repair by removing 5’-deoxyribose phosphate and base insertion. However, the recent researches indicate that polymerase β might take part in a wide spectrum of DNA metabolism reactions, including long patch base excision repair, DNA replication, recombination, meiosis and transleisional DNA synthesis. Because of its wide and important cellular function, an inappropriate intracellular polymerase β level might be associated with genomic instability. Down-regulation or mutation of polymerase β is mutagenic due to deficient in DNA repair, while overexpression of this error-prone β polymerase might perturb the normal function of other accurate polymerases and cause genomic instability as well. 展开更多
关键词 dna聚合酶β 碱基切除修复 dna复制 dna重组 遗传不稳定
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Bst DNA聚合酶的纯化及等温扩增检测体系的构建 被引量:1
10
作者 谭拥军 吴莎莎 +1 位作者 谭桂湘 向勤 《湖南大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第12期98-106,共9页
Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement... Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement的原核表达质粒,采用原核蛋白表达系统和His-Tag亲和纯化手段,制备成本低,活性高,特异性强的Bst DNA聚合酶.同时,针对特定的模板,对自制Bst DNA聚合酶的扩增反应进行了进一步优化,用不同的产物鉴定方法对扩增效果进行检测,并最终筛选出该酶最优的扩增反应条件为60 mM K^+、30 mM(NH4)2SO4、pH为9.0.最后,验证了Bst DNA聚合酶能用于快速准确检测肺炎支原体、肺炎衣原体,降低了相关病原体核酸检测的成本,为之后核酸检测在基层医疗的更广泛应用提供了条件. 展开更多
关键词 Bst dna聚合 重组蛋白 扩增 核酸检测
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Klenow大片段的聚合酶及核酸酶活性在重组质粒构建中的巧用 被引量:1
11
作者 刘定燮 戴琳 骆抗先 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第8期630-630,632,共2页
目的 探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3'凹端或3'凸端的可行性。方法 以构建乙型肝水(乙肝)病毒S基因的真核表达载体为例,用Kpn I及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因的质粒,切除质粒中的前S区基因序列。通过K... 目的 探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3'凹端或3'凸端的可行性。方法 以构建乙型肝水(乙肝)病毒S基因的真核表达载体为例,用Kpn I及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因的质粒,切除质粒中的前S区基因序列。通过Klenow大片段的核酸外切酶的活性切平质粒Kpn I切口的3'凸端,再利用其聚合酶活性补平Xhol I的3'凹端。处理后的质粒经连接酶作用而自身环化后,转化并筛选阳性克隆。结果 重组质粒获得了限制性内切酶分析的证实;对重组质粒的序列测定表明,Kpn I及Xhol I酶切端经Klenow大片段切(补)平并重新连接后其接续口端序列与预期一致。结论 对质粒作内部改建中,质粒两端分别为3'凸端及3'凹端时,可以同时利用Klenow大片段的两种酶活性将DNA末端修饰为平端,以便于使质粒自身环化。 展开更多
关键词 dna 互补 重组质粒 大肠杆菌 核酸 聚合 Klenow大片段
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家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测
12
作者 陈慧卿 楚茨 周亚竟 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1049-1052,共4页
DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-... DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。 展开更多
关键词 dna聚合 家蚕杆状病毒表达系统 重组蛋白 活性
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聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1与DNA双链断裂修复的相关性 被引量:4
13
作者 陈利俊 马丽 李莉萍 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期620-626,共7页
DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是细胞最严重的DNA损伤形式。细胞通过同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径修复DNA双链断裂损伤。聚腺苷二磷酸核糖基化(poly(ADP-rib... DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是细胞最严重的DNA损伤形式。细胞通过同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径修复DNA双链断裂损伤。聚腺苷二磷酸核糖基化(poly(ADP-ribosyl)ation,PARylation)是蛋白质翻译后修饰过程,这个过程由聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶家族(poly(ADP-ribose)polymerases,PARPs)催化完成。PARP1作为PARPs家族最重要的成员,其在DNA损伤应答方面发挥重要作用。研究显示,PARP1在DSBs修复过程中发挥关键作用,参与DSBs的早期应答反应及其具体修复途径,可依据KU蛋白的存在与否发挥不同的特定作用。本文较全面地综述了PARP1在DNA双链断裂修复方面的潜在作用,将为临床疾病的诊治提供新的思路。 展开更多
关键词 聚腺苷二磷酸-核糖聚合1 dna双链断裂 同源重组 非同源末端连接
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重组PCR——一种快速体外基因重组技术 被引量:9
14
作者 张梅 司履生 《西安医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期270-271,275,共3页
重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术 ,在基因重组过程中 ,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约 ,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶 ,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。
关键词 重组PCR 体外基因重组 重叠引物 dna聚合
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重组Klenow-HSA融合蛋白的构建、纯化及其稳定性 被引量:2
15
作者 曾令娥 黄晶 +3 位作者 白惠卿 范慧 黄大无 王露 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期684-687,共4页
目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯... 目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯化 ,并进行活性及稳定性的研究。结果 :发现Klenow HSA融合蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达。体外实验证实这种融合蛋白具有与Klenow聚合酶相同的活性 ,其稳定性明显提高。结论 :融合蛋白确实能增加Klenow酶的热稳定性和储存稳定性 。 展开更多
关键词 dna聚合 I/生物合成 人血清白蛋白 重组融合蛋白质类/生物合成 dna聚合 I Klenow片段
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靶向ORFV-DNA ploymerase基因shRNA表达载体的构建 被引量:3
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作者 于永忠 郭雯 +2 位作者 吴欣媛 王金珍 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2012年第4期38-41,共4页
羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(ORFV)引起的人畜共患的一种急性、接触性和具有高度嗜上皮性传染病,主要感染绵羊、山羊和人。由于该病缺乏全身性感染症状,因此在防治上也缺乏有效的疫苗或抗体。RNA干扰技术是目前较为成熟的抑制目的基因表... 羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(ORFV)引起的人畜共患的一种急性、接触性和具有高度嗜上皮性传染病,主要感染绵羊、山羊和人。由于该病缺乏全身性感染症状,因此在防治上也缺乏有效的疫苗或抗体。RNA干扰技术是目前较为成熟的抑制目的基因表达生物技术。ORFV的DNA ploymerase是病毒复制的关键酶。研究运用RNA干扰技术针对ORFV的DNAploymerase基因进行体外基因沉默研究,通过网络自动筛选平台设计并合成3个short-hairpin RNAs(shRNAs)片段,并与含U6启动子的pLL3.7质粒构建重组载体,结果表明pLL3.7-D596为重组阳性,进一步测序结果正确。研究可以为靶向ORFV-DNAploymerase基因的体内基因沉默提供参考数据。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 dna聚合 shRNA片段 重组载体
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重组PCR快速基因定点突变的技术方法 被引量:1
17
作者 赵焕英 赵君朋 +1 位作者 杨慧 徐群渊 《首都医科大学学报》 CAS 2007年第2期260-261,共2页
关键词 基因定点突变 重组PCR 聚合链式反应 dna序列 PCR技术 基因突变 甘氨酸 丝氨酸
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蛋白激酶C突变体的构建及其在C2C12细胞中的表达
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作者 刘新华 陈瑞华 +3 位作者 陆纲 鹿培源 贾弘禔 李刚 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期209-209,共1页
关键词 聚合链反应 蛋白激C dna 重组
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一种鉴定重组子的快速简便方法
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作者 何文芳 孙晗笑 谢作煊 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 2001年第4期359-359,共1页
关键词 dna 重组 聚合链反应 质粒
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油脂改良和与耐冷性有关的脂肪酸酶的克隆
20
作者 孙国凤 《生物技术通报》 CAS CSCD 1991年第5期8-8,共1页
基础生物学研究所教授村田纪夫等从蓝藻SynechocystisPCC6803成功地克隆出脂肪酸不饱和化酶(desA).对催化结合于甘油3磷酸的脂肪酸不饱和化的酶进行克隆还是第一次.脂肪酸不饱和化酶是油脂改良的关键酶.美国Monsanto公司、DuPont公司、C... 基础生物学研究所教授村田纪夫等从蓝藻SynechocystisPCC6803成功地克隆出脂肪酸不饱和化酶(desA).对催化结合于甘油3磷酸的脂肪酸不饱和化的酶进行克隆还是第一次.脂肪酸不饱和化酶是油脂改良的关键酶.美国Monsanto公司、DuPont公司、Calgene公司、BioTechnica公司.DNA Plant Technology公司、Sungene公司、英国Unilever公司等主要植物生物企业都集中到这方面的研究开发. 展开更多
关键词 耐冷性 关键 Monsanto 生物学研究所 主要植物 dna 调节表 碱基序列 野生型 同源重组
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