重组酶聚合酶侧流层析技术检测新冠病毒核酸快速诊断方法的初步建立 被引量：3

1

作者 张淼源 卢佩珊 +3 位作者 李佳宁 李佳乐 郑炜欣 欧阳岁东 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期577-581,共5页

目的建立重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(RPA-LFD)检测新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸快速诊断方法,为基层医院和边远地区防控新冠病毒疫情提供技术支持。方法根据新冠病毒N基因核苷酸序列中保守序列,通过生物信息学软件分析、设计和筛选最佳... 目的建立重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(RPA-LFD)检测新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸快速诊断方法,为基层医院和边远地区防控新冠病毒疫情提供技术支持。方法根据新冠病毒N基因核苷酸序列中保守序列,通过生物信息学软件分析、设计和筛选最佳的重组酶聚合酶扩增引物及侧流层试纸探针,优化重组酶聚合酶扩增反应条件以及检验建立方法的灵敏性和特异性。结果利用RPA-LFD法在37℃下反应15 min可检测到每个反应最低100 fg含量的新冠病毒,并与流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒没有交叉反应,因此据此可以建立灵敏性高、特异性强和可操作性强的新冠病毒快速诊断方法。结论通过RPA-LFD技术建立的新冠病毒快速诊断方法可获得较为理想的灵敏度、特异性,为进一步研制新冠病毒核酸快速诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 新冠病毒 新冠肺炎 重组酶聚合酶侧流层析技术 快速诊断

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪 被引量：2

2

作者 王慧芳 喻勇新 +3 位作者 李晨虹 陈文隽 凌岚馨 周颖 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第17期291-297,共7页

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计... 建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。 展开更多

关键词 大西洋鳕鱼 重组酶聚合酶扩增反应 真伪 侧流层析试纸条技术 现场快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立 被引量：16

3

作者 樊晓旭 宋翥远 +11 位作者 赵永刚 赵明 董雅琴 张永强 李园丽 迟田英 刘春菊 戈胜强 张志诚 吴晓东 王树双 王志亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期406-410,共5页

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病... 为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。 展开更多

关键词 塞尼卡谷病毒 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于重组酶聚合酶等温扩增的间日疟快速可视化检测研究

4

作者 李诗慧 高春花 +5 位作者 危芙蓉 王多全 贾孝凯 张璟 王颖 石锋 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第4期413-418,共6页

目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(Ge... 目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(GenBank:DQ660817.1)为靶序列,利用Primer Premier 5设计引物和探针,以间日疟原虫标准质粒(pUCPv)为模板进行RPA和LFD检测,建立敏感、特异的间日疟原虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测浓度为1×10^(3)、1×10^(2)、1×10^(1)、1×10^(0)、1×10^(-1) copies/μL的pUCPv,评价其灵敏度;用RPA-LFD检测恶性疟、三日疟、卵形疟、内脏利什曼病患者及健康参与者全血DNA,评价其特异性,并利用该方法检测24例确诊间日疟患者全血DNA样本,评价其敏感性。结果建立了敏感、特异、快速可视化检测间日疟核酸的RPA-LFD方法,该方法能够在39℃恒温条件下20 min内完成对间日疟原虫的检测,灵敏度可达1 copy/μL,与其他疟原虫、内脏利什曼原虫无任何明显交叉反应,特异性为100%。24例确诊间日疟患者的DNA样本检测阳性率为100%。结论建立的检测间日疟原虫核酸的快速可视化RPA-LFD方法敏感性高、特异性好、操作简便,且只需简易加热装置即可进行,适用于低资源环境下间日疟原虫的快速检测。 展开更多

关键词 间日疟原虫 重组酶聚合酶等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

5

作者 韩进刚 王菁 +3 位作者 徐赟霞 刘群 罗璋 冯守明 《河北渔业》 2022年第6期29-34,共6页

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法... 为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型(CyHV-2) 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试剂条(LFD) 直接RPA法

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量：9

6

作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析(LFD) 快速诊断方法

在线阅读 下载PDF 职称材料

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立 被引量：1

7

作者 谷庆花 李铭远 +1 位作者 司鑫鑫 高嵩 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2022年第1期52-57,共6页

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的... 本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。 展开更多

关键词 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条 现场检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用

8

作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页

研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多

关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型RPA 侧向流RPA试纸条 黄颡鱼

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于RPA-LFD的鸭星状病毒2型核酸快速可视化检测技术

9

作者 何书海 晋丹丹 +4 位作者 薛玉坤 曲哲会 鲁绍芳 董建国 胡建新 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期46-51,共6页

为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;... 为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;进一步验证该方法的灵敏性、特异性和准确性。结果显示,筛选获得1对引物和匹配探针适用于DAstV-2核酸的RPA-LFD检测,探针的最佳工作浓度为5μmol/L;建立的RPA-LFD检测方法对DAstV-2核酸的最低检测限为3×10^(1)copies/μL;可特异性检测DAstV-2核酸,对鸭肝炎病毒(DHV)、鹅星状病毒(GAstV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鸭瘟病毒(DPV)的检测结果均为阴性;对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织病毒核酸样本的检测结果显示,建立的RPA-LFD与实时荧光定量PCR检测结果的符合率为100%,且该检测方法更加便捷。本试验结果表明,利用RPA-LFD检测DAstV-2核酸灵敏度高、特异性强、准确性高,操作简单、检测快速,可在38℃恒温条件下15 min内实现DAstV-2核酸的快速可视化检测。 展开更多

关键词 鸭星状病毒2型 重组酶聚合酶扩增 横向侧流层析试纸条 快速检测 可视化

在线阅读 下载PDF 职称材料

梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发 被引量：1

10

作者 蒲姝旸 张瑾逸 +4 位作者 暴晓阳 孟青青 田茜 蔡璐璐 赵文军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期242-249,282,共9页

梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全... 梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全球防控梨火疫病菌扩散危害的重要方法之一,目前我国植物检疫部门主要从实验室分离鉴定、分子检测和田间症状识别及快速检测方面开展工作。本研究基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和E.amylovora 16S-23S ITS区间的保守序列设计的引物和探针,建立了实时荧光RPA和侧流层析试纸条RPA两种检测方法。经测试,在39℃条件下,这两种检测方法都具有良好的特异性,分别能在20 min和10 min内完成扩增。实时荧光RPA对E.amylovora菌株DNA的检测阈值为1.38×10^(-2)ng/μL;侧流层析试纸条RPA对E.amylovora菌悬液和DNA的检测阈值分别为10^(4)cfu/mL和1.38×10^(-3)ng/μL。侧流层析试纸条RPA体系因反应快速、读取结果方便、不需要复杂仪器操作可以满足现场快速检测的需求。 展开更多

关键词 梨火疫病 快速检测 重组酶聚合酶扩增(RPA) 实时荧光型RPA 侧流层析试纸条型RPA

在线阅读 下载PDF 职称材料

适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

11

作者 姚梦丽 白昌明 +1 位作者 王崇明 辛鲁生 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2024年第4期166-174,共9页

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流... 为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。 展开更多

关键词 核酸释放剂 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试纸条(LFD) 虾肝胰腺 病原快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于RPA-CRISPR/Cas12a的杰克贝尔氏粉蚧可视化快速检测体系建立 被引量：1

12

作者 陈燕婷 史梦竹 +4 位作者 胡美玲 陈彦 杨秀娟 赵建伟 李建宇 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期830-839,共10页

【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral f... 【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral flow assay)体系,以实现在田间或者口岸等资源受限场所的现场实时检测。【方法】基于杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因序列设计RPA特异性引物和crRNA,分别对杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧(木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、柑橘棘粉蚧Pseudococcus cryptus和奥德曼粉蚧Pseudococcus odermatti)进行RPA和CRISPR/Cas12a检测,验证该体系的特异性。对RPA-CRISPR/Cas12a检测体系进行条件优化,包括RPA反应时间、Cas12a和crRNA的浓度比及其浓度、荧光报告分子FQ Reporter的浓度、试纸条报告分子LF Reporter的浓度以及CRISPR/Cas12a体系反应时间,筛选获得最佳检测体系。【结果】利用设计的RPA特异性引物的RPA体系可扩增出一条201 bp的杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因片段,结合CRISPR/Cas12a反应体系,可特异性地将杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧区分开,并呈现可视化结果。通过条件优化建立的对杰克贝尔氏粉蚧的最适RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中,RPA反应时间为20 min,Cas12a和crRNA浓度比为1∶1且在体系中的浓度均为50 nmol/L,LF Reporter浓度为500 nmol/L,LF Reporter浓度为800 nmol/L,荧光检测体系和侧向流层析检测体系的反应时间分别为5和20 min。【结论】本研究建立了一套杰克贝尔氏粉蚧RPA-CRISPR/Cas12a检测体系,具有高特异性、快速(25~40 min)、不依赖仪器设备且结果可视化的优点。该检测体系在入侵粉蚧的早期识别和现场检测具有重要的应用价值,为制定合理的管理策略提供了指导。 展开更多

关键词 杰克贝尔氏粉蚧 重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a检测 荧光检测 侧向流层析检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

猫冠状病毒RPA-LFD快速检测方法的建立

13

作者 白雪瑞 李尚同 +5 位作者 战晓燕 王金福 钟登科 孙卫东 蒋蔚 滑志民 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期67-72,共6页

为快速精准检测猫冠状病毒(FCoV),用FCoV的7b基因设计引物与探针,构建重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)方法。通过筛选最佳反应时间与温度,测定其敏感性和特异性。结果显示,RPA-LFD方法在37℃、15 min条件下,最低检测限为1 pg/... 为快速精准检测猫冠状病毒(FCoV),用FCoV的7b基因设计引物与探针,构建重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)方法。通过筛选最佳反应时间与温度,测定其敏感性和特异性。结果显示,RPA-LFD方法在37℃、15 min条件下,最低检测限为1 pg/μL,比普通PCR灵敏1000倍。同时,该方法与猫杯状病毒、猫疱疹病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒均无交叉反应。通过9份临床病例的猫腹水样品检测,结果显示RPA-LFD与普通PCR结果一致。表明该方法快捷简便、特异性和灵敏性好,适用于快速检测FCoV感染。 展开更多

关键词 猫冠状病毒 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条

在线阅读 下载PDF 职称材料

葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系的建立

14

作者 黄强 张强强 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第4期89-97,共9页

【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜... 【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计了PF1/PR1、PF2/PR2和PF3/PR3共3对引物及探针RPA-P,对葡萄霜霉病菌DNA的ITS序列进行PCR扩增,建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,并对其反应条件进行优化,对其特异性和灵敏性进行检测。【结果】建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,引物PF1/PR1和探针RPA-P对靶标片段具有良好的特异性,检测条件为36℃扩增30 min,对葡萄霜霉病菌具有特异性;最低检测下限为10 pg/μL,灵敏性略低于常规PCR(1 pg/μL)和荧光定量PCR(100 fg/μL);对田间发病叶片的检测结果与常规PCR一致,准确性高。【结论】建立的葡萄霜霉病菌重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测体系,可以对目标物质进行快速、可视化检测,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适宜推广使用。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 葡萄生单轴霉 重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测 病原检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

RAA-CRISPR/cas13a(cpf1)-LFD兔出血症2型诊断方法的建立

15

作者 林芸 王媛 +3 位作者 刘立荣 陈佳祺 陈蓓蕾 王全溪 《福建农业学报》 北大核心 2025年第2期151-157,共7页

【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment... 【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment)分析兔出血症1型(rabbit hemorrhagic disease type 1, RHdV-1)和兔出血症2型RHdV-2基因组,筛选出RHdV-2特异且保守的VP60基因片段。基于此片段,设计重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流层析试纸条检测(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)的探针与特异性引物。然后在RAA扩增产物的基础上,设计并筛选最适CRISPR衍生RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA),并对簇状规律间隔性成簇短回文重复序列相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a, CRISPR-Cas13a)的反应体系进行优化。筛选针对RHdV-2的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD诊断方法的最适反应时间,并对该方法的敏感性、特异性进行评价。最后使用该方法对临床31份疑似样品进行检测。【结果】同源性分析结果表明,RHdV-2的VP60基因上存在特异且保守的序列,合成VP60特异性引物进行RAA扩增。以RAA产物作为反应模板,发现crRNA1特异性最好。反应时间结果表明,在RAA基础反应后仅再需10 min即可在试纸条上出现明显阳性结果。敏感性试验结果显示,以重组质粒为模板,最低检出质粒拷贝数为6.7×10^(1) copies·μL^(-1)。特异性结果表明,只有RHdV-2为阳性,表明该方法特异性好。采用RAA-CRISPR/Cas13a(cpf1)-LFD法对31份临床样品进行检测,检出阳性样品10份,检出率为30.3%。【结论】本研究建立了一种针对RHdV-2的快速、简便的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD检测方法,该方法对快速确诊RHdV-2以及科学防控该病具有十分重要的意义。 展开更多

关键词 重组酶介导的核酸等温扩增 CRISPR-Cas13a系统 侧流层析试纸条 兔出血症病毒2型 诊断方法

在线阅读 下载PDF 职称材料

K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及RPA-LFD快速检测方法的建立与应用

16

作者 喻华英 曾婷婷 +8 位作者 杨宗维 王粲 牙侯勋 万丽君 罗思思 李孟 谢芝勋 于美玲 谢丽基 《中国家禽》 北大核心 2025年第7期47-55,共9页

为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检... 为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检测方法。试验首先通过细胞培养分离鉴定出一株ALV-K,并以此分离株的前病毒DNA作为建立检测方法的模板;其次,针对ALV-K gp85基因保守位置设计引物和探针,优化反应体系的引物浓度、探针浓度和反应温度,在此基础上进行敏感性预试验并以预试验检测限优化反应时间;最后,以优化反应时间进行敏感性试验、稳定性试验及特异性试验。结果显示:建立的ALV-K RPA-LFD反应体系在引物浓度为0.45 mmol/L,探针浓度为0.14 mmol/L,39℃条件下反应21 min,其检测限为4.86×10^(2) copies/反应的ALV-K DNA,并且不与其他常见禽类病原体核酸发生非特异扩增反应;30份临床病料中有14份ALV-K阳性,与单重PCR方法结果一致。研究表明,建立的ALV-K RPA-LFD检测方法具有快速、特异、操作简单,不需要复杂仪器,能够直观地观察结果的优点,适用于临床快速检测ALV-K,特别是实验室条件有限的检测场景。 展开更多

关键词 家禽 K亚群禽白血病病毒 重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌 被引量：12

17

作者 张闪闪 何斌 +6 位作者 李书光 刘明成 姜金庆 胡建和 雷连成 沈志强 夏小静 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期538-547,共10页

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,... 旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示:猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^(-1),优于常规PCR方法,且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围(30~45℃)内高效进行,20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估,其检出率高于细菌分离与常规PCR方法,具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点,同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于野外及现场检测。 展开更多

关键词 猪链球菌 重组酶聚合酶等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

十足目虹彩病毒1 RAA-LFD快检方法建立与应用

18

作者 田飞焱 吴众怡 +6 位作者 徐节华 黄海莉 裴建明 孟霞 刘文珍 周文华 谢世红 《中国动物检疫》 2025年第2期100-107,共8页

为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的... 为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的RAA-LFD方法。该方法能够在37℃下恒温反应20 min,并在LFD显色5 min后判读结果;对嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)以及致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(Vp_(AHPND))等虾类病原无交叉反应,仅对DIV1检测呈阳性;最低检测限为5.25×10^(1) copies/反应;组内和组间重复性试验结果良好。使用该方法与已报道的套式PCR和qPCR方法对采集的60份克氏原螯虾样品进行平行检测,检测结果与套式PCR一致,与qPCR方法相比,其敏感性和特异性分别为83.3%和100%。结果表明,该方法反应快速、操作简便、灵敏度高、特异性好,具有良好的重复性和可信度,适用于临床样品的现场检测。 展开更多

关键词 十足目虹彩病毒1 重组酶介导扩增技术 侧流层析技术 恒温扩增 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立 被引量：4

19

作者 刘文俊 阳佑天 +5 位作者 易华东 邓汝森 杨培洁 付新亮 黄运茂 田允波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期474-478,共5页

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,... 为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条 A型流感病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用 被引量：4

20

作者 袁雪梅 陈静 +5 位作者 黄雷 蔺凌云 潘晓艺 彭先启 焦锦彪 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期505-510,共6页

为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察... 为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD)。提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品p UC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验。结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×10^(1)拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好。利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与q PCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条技术 十足目虹彩病毒I

在线阅读 下载PDF 职称材料