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定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建
1
作者
李仙红
贾润清
+4 位作者
王友亮
漫未玲
朱天昊
阎新龙
林艳丽
《中国生物化学与分子生物学报》
北大核心
2025年第4期576-585,共10页
对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建...
对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。
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关键词
β-1
4半乳糖基转移
酶
α-2
6-唾液酸转移
酶
1
N-乙酰氨基糖基转移
酶
Ⅲ
规律成簇的间隔短回文重复
技术
重组酶介导的盒式交换技术
中国仓鼠卵巢细胞
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职称材料
斑马鱼胚胎中Cre/lox介导的定点整合
2
作者
秦瑶
汪亚平
+1 位作者
胡炜
朱作言
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第10期1072-1076,共5页
采用两种类型的lox突变体和双色荧光报告基因,构建了双交换载体pCMVlox66-CreintEGFPlox2272和plox71RFPlox2272。将Cre酶基因插入载体pCS2＋,获得了体外转录模板质粒pCSCre。为检测Cre重组酶对斑马鱼胚胎发育的影响,将体外转录的Cre RN...
采用两种类型的lox突变体和双色荧光报告基因,构建了双交换载体pCMVlox66-CreintEGFPlox2272和plox71RFPlox2272。将Cre酶基因插入载体pCS2＋,获得了体外转录模板质粒pCSCre。为检测Cre重组酶对斑马鱼胚胎发育的影响,将体外转录的Cre RNA稀释至不同浓度并分别注射入斑马鱼受精卵。结果显示,当Cre RNA浓度高于200ng/μL时会导致高死亡率和高畸形率;而浓度低于100ng/μL的Cre RNA对胚胎发育不造成影响。进一步将50ng/μL的Cre RNA同双交换载体共注射到斑马鱼受精卵中,筛选到发红色荧光的胚胎。PCR检测和测序鉴定证实,在Cre重组酶作用下,两个载体中lox位点间的荧光基因发生了置换反应。实验结果表明,Cre/lox系统介导的盒式交换反应是实现转基因鱼外源基因定点整合的有效策略。
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关键词
CRE
重组
酶
斑马鱼
定点整合
盒
式
交换
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职称材料
题名
定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建
1
作者
李仙红
贾润清
王友亮
漫未玲
朱天昊
阎新龙
林艳丽
机构
北京工业大学化学与生命学院生物系
军事科学院军事医学研究院前沿生物技术实验室
沈阳农业大学生物科学技术学院生物医药系
出处
《中国生物化学与分子生物学报》
北大核心
2025年第4期576-585,共10页
文摘
对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。
关键词
β-1
4半乳糖基转移
酶
α-2
6-唾液酸转移
酶
1
N-乙酰氨基糖基转移
酶
Ⅲ
规律成簇的间隔短回文重复
技术
重组酶介导的盒式交换技术
中国仓鼠卵巢细胞
Keywords
β-1,4 galactosyltransferase(B4GALT1)
α-2,6-sialyltransferase 1(ST6GAL1)
N-acetaminoglycosyltransferase III(GnTⅢ)
clustered regularly interspaced short palindromic repeats technology(CRISPR/Cas9)
recombinase-mediated cassette exchange technology
Chinese hamster ovary cells(CHO)
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
斑马鱼胚胎中Cre/lox介导的定点整合
2
作者
秦瑶
汪亚平
胡炜
朱作言
机构
中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室
中国科学院研究生院
出处
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第10期1072-1076,共5页
基金
973计划（2001CB109006）和国家自然科学基金（30130050）资助项目.
文摘
采用两种类型的lox突变体和双色荧光报告基因,构建了双交换载体pCMVlox66-CreintEGFPlox2272和plox71RFPlox2272。将Cre酶基因插入载体pCS2＋,获得了体外转录模板质粒pCSCre。为检测Cre重组酶对斑马鱼胚胎发育的影响,将体外转录的Cre RNA稀释至不同浓度并分别注射入斑马鱼受精卵。结果显示,当Cre RNA浓度高于200ng/μL时会导致高死亡率和高畸形率;而浓度低于100ng/μL的Cre RNA对胚胎发育不造成影响。进一步将50ng/μL的Cre RNA同双交换载体共注射到斑马鱼受精卵中,筛选到发红色荧光的胚胎。PCR检测和测序鉴定证实,在Cre重组酶作用下,两个载体中lox位点间的荧光基因发生了置换反应。实验结果表明,Cre/lox系统介导的盒式交换反应是实现转基因鱼外源基因定点整合的有效策略。
关键词
CRE
重组
酶
斑马鱼
定点整合
盒
式
交换
Keywords
Cre recombinase, zebra_fish, site-specific recombination, cassete exchange
分类号
Q784 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建
李仙红
贾润清
王友亮
漫未玲
朱天昊
阎新龙
林艳丽
《中国生物化学与分子生物学报》
北大核心
2025
0
在线阅读
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职称材料
2
斑马鱼胚胎中Cre/lox介导的定点整合
秦瑶
汪亚平
胡炜
朱作言
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2007
0
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职称材料
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