基于重组酶介导等温核酸扩增技术快速检测食品中骆驼源性成分的方法建立及评价

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作者 周臣清 张娟 +3 位作者 綦艳 赵玲 黄宝莹 杨纯佳 《中国乳品工业》 北大核心 2025年第2期75-80,共6页

文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其... 文章开发一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)的方法,实现对食品中骆驼源性成分快速检测。针对骆驼细胞色素B(Cytochrome b,Cyt b)基因设计特异性引物,对建立的RAA体系优化其反应扩增条件,评估其特异性和灵敏度,并用建立的RAA法与GB/T 38164标准方法分别对24份市售骆驼制品进行检测并比对结果。结果表明,本研究建立的RAA法特异性强,乳及乳制品检出限为1.0%,肉及肉制品检出限为0.1%,且2种方法对24份骆驼乳肉及其制品检测结果一致。因此,本研究开发的RAA方法具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,市场应用前景广阔。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 骆驼源性成分 细胞色素B基因 快速检测

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鉴别鸽新城疫病毒野毒株与疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法的建立

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作者 杜文珍 吴颖臻 +4 位作者 王鹏 陆凡 刘大利 梁海皇 韦天超 《广西畜牧兽医》 2024年第2期47-50,共4页

为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV... 为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示:该技术在15℃~39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。 展开更多

关键词 鸽新城疫病毒 重组酶介导的等温扩增方法 快速检测

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多黏菌素耐药基因mcr-1重组酶介导扩增方法的建立及应用 被引量：6

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作者 车勇良 陈秋勇 +4 位作者 陈如敬 吴学敏 王隆柏 刘玉涛 周伦江 《动物医学进展》 北大核心 2022年第8期46-49,共4页

根据多黏菌素耐药基因mcr-1的保守序列,设计合成一对重组酶介导扩增方法(RAA)特异性引物和一条FAM标记的荧光探针,优化扩增条件,建立了检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA方法,验证其特异性和敏感性,并应用于临床检测。结果显示,建立的RAA... 根据多黏菌素耐药基因mcr-1的保守序列,设计合成一对重组酶介导扩增方法(RAA)特异性引物和一条FAM标记的荧光探针,优化扩增条件,建立了检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA方法,验证其特异性和敏感性,并应用于临床检测。结果显示,建立的RAA方法只需21 min就能出结果,能特异性地检测多黏菌素耐药基因mcr-1,最低能检测出10~2的mcr-1阳性质粒拷贝数,也可很好地检测出临床样品中的mcr-1基因。4株临床分离大肠埃希氏菌株样品,有2株mcr-1基因阳性,2株为mcr-1基因阴性。 展开更多

关键词 多黏菌素 耐药基因 mcr-1 重组酶介导扩增方法

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双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

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作者 邓迎春 郭旭光 +3 位作者 牛会敏 任宝红 韩小改 郭瑞 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期151-157,共7页

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型... 目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。 展开更多

关键词 荧光逆转录-聚合酶链式反应 恒温荧光逆转录-重组酶介导等温扩增 GⅠ型诺如病毒 GⅡ型诺如病毒

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用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉 被引量：5

5

作者 廖新辉 易浔飞 +1 位作者 崔智慧 兰小鹏 《临床检验杂志》 CAS CSCD 2015年第3期214-218,共5页

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化... 目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为：引物长度：18-30 bp;产物长度：200-700 bp;扩增温度：37-42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间：15-40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 转录间隔区1-2 烟曲霉

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重组酶介导等温核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的应用 被引量：8

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作者 秦爱 刘明明 +2 位作者 邓方进 余秋地 肖昭竞 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第10期278-286,共9页

重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)是一种新型的国产等温扩增技术,其扩增反应可以在恒定温度(37~42℃)下快速完成,具有较高检测效率,且对精密仪器和检测场地的要求较低,更能应对大批量筛查、应急处理等应... 重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)是一种新型的国产等温扩增技术,其扩增反应可以在恒定温度(37~42℃)下快速完成,具有较高检测效率,且对精密仪器和检测场地的要求较低,更能应对大批量筛查、应急处理等应用场景。经10年的科学研究和实践应用, RAA技术已取得了诸多突破性成果,本文介绍了RAA技术的反应原理,综述了近3年RAA技术及其扩展技术在食源性致病菌检测中的研究进展,总结了RAA技术在样品前处理、假阳性和假阴性、检测通量、试剂盒开发等方面存在的技术难点,并对未来的研究方向提出了若干建议,以期为RAA技术在食源性致病菌快速检测中的应用推广提供研究思路。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增 食源性致病菌 分子检测

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乙脑病毒重组酶介导逆转录扩增检测方法的建立 被引量：2

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作者 刘建礼 焦艳丽 +4 位作者 董晨浩 楚单锐 种文文 肖利力 孙慧晴 《口岸卫生控制》 2022年第2期34-37,共4页

目的建立乙脑病毒重组酶介导逆转录核酸扩增(RT-RAA)快速检测方法。方法根据乙脑病毒NS1基因片段设计引物和探针,通过优化筛选确定最佳引物组合,建立乙脑病毒RT-RAA检测方法,并对其检测灵敏度和特异性进行测试。结果建立的乙脑病毒RT-RA... 目的建立乙脑病毒重组酶介导逆转录核酸扩增(RT-RAA)快速检测方法。方法根据乙脑病毒NS1基因片段设计引物和探针,通过优化筛选确定最佳引物组合,建立乙脑病毒RT-RAA检测方法,并对其检测灵敏度和特异性进行测试。结果建立的乙脑病毒RT-RAA检测方法灵敏度可达10拷贝,方法检测时间少于20 min,最快2-3 min即可观察到明确荧光扩增信号,与登革病毒、黄热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒及正常血液样本无交叉反应。结论建立的乙脑病毒RT-RAA检测方法灵敏、快速、特异性好,适用于口岸现场乙脑病毒的快速检测。 展开更多

关键词 重组酶介导核酸扩增技术 乙脑病毒

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重组酶介导的油菜茎基溃疡病菌荧光核酸扩增检测体系的建立

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作者 陈吴健 张巧琦 +5 位作者 魏晓洁 朱青青 郭利川 应清界 梅高甫 曹栋栋 《浙江农业科学》 2023年第1期79-82,共4页

本文通过重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法。根据油菜茎基溃疡病菌的特异基因LMR1-D保守序列设计引物和探针,分析建立的RAA方法的灵敏度和特异性。该方法在39℃下... 本文通过重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法。根据油菜茎基溃疡病菌的特异基因LMR1-D保守序列设计引物和探针,分析建立的RAA方法的灵敏度和特异性。该方法在39℃下,反应时间段(<20 min),检测下限可达10拷贝·mL^(-1),与油菜黑胫病菌等近似种无交叉反应,具有良好的特异性。本研究建立的RAA方法反应速度快、特异性强、灵敏度高,适用于油菜茎基溃疡病菌的快速检测。 展开更多

关键词 核酸扩增技术 油菜 茎基溃疡病菌 重组酶介导扩增 种传病害

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基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

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作者 郭瑞 赵林萍 +2 位作者 韩小改 郭毅 任宝红 《食品安全导刊》 2023年第32期101-104,108,共5页

目的:建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法:针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针... 目的:建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法:针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果:所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^(-1),且与其他菌株核酸无交叉反应。结论:成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 重组酶介导等温核酸扩增 hlyA 核酸检测

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应用重组酶介导逆转录扩增技术快速登革病毒血清型鉴定 被引量：2

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作者 张勤 王永亮 +3 位作者 曹晓婉 左锋 邱英华 付玉和 《口岸卫生控制》 2020年第6期21-25,共5页

目的本研究建立了基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速鉴定登革病毒血清型的方法。方法选取登革病毒基因组NS1基因片段分别设计DV I型、DVⅡ型、DVⅢ型和DVⅣ型引物和探针,建立登革病毒血清型鉴定RT-RAA检测方法,并分别对其... 目的本研究建立了基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速鉴定登革病毒血清型的方法。方法选取登革病毒基因组NS1基因片段分别设计DV I型、DVⅡ型、DVⅢ型和DVⅣ型引物和探针,建立登革病毒血清型鉴定RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<30min),与基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒等黄病毒属病毒及DV不同血清型间无交叉反应,检测的灵敏度可达102copies/μl,试验的重复性好。结论建立的登革病毒血清型鉴定RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,为探究登革病毒是否本土化,确定登革病毒分子流行病学趋势提供技术支持。 展开更多

关键词 重组酶介导核酸扩增 登革病毒 血清型鉴定

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重组酶扩增技术概述及应用研究进展 被引量：1

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作者 陈兴浩 李鑫 +10 位作者 沈海潇 张校培 徐丽娜 张鹤平 葛菲菲 杨显超 刘健 白艺兰 王建 杨德全 赵洪进 《中国动物检疫》 CAS 2023年第11期76-81,共6页

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒... 重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增技术 酶促重组等温扩增技术 重组酶介导等温扩增技术 多酶恒温核酸快速扩增技术

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重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病诊断中的应用研究进展 被引量：1

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作者 胡清霞 李颖 +4 位作者 张琰杰 吕妮 李鹏 杨增岐 王兴龙 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期82-86,共5页

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种基于T4噬菌体复制机理为主要反应机理的核酸恒温扩增技术,广泛应用于动物疫病诊断、动物食品安全和遗传分析等领域。反应可在25~42℃温度条件下20 min完成快速扩增,具有条件温和、灵敏度高、特异性好、... 重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种基于T4噬菌体复制机理为主要反应机理的核酸恒温扩增技术,广泛应用于动物疫病诊断、动物食品安全和遗传分析等领域。反应可在25~42℃温度条件下20 min完成快速扩增,具有条件温和、灵敏度高、特异性好、无需昂贵试验仪器和简便快捷等优点,适用于现场快速检测,已被应用于常见动物疫病的诊断。为让更多技术人员了解RPA技术诊断的优势,论文对RPA技术原理、引物探针设计、检测方法及在动物疫病诊断中的应用进行了分析。 展开更多

关键词 核酸恒温扩增技术 重组酶聚合酶扩增技术 动物疫病 诊断

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环介导等温扩增技术在兽医中的应用

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作者 杨旭东 王刚 《养殖技术顾问》 2013年第10期85-85,共1页

环介导等温扩增技术（LAMP）是由Notomi等于2000年开发的新颖的恒温核酸扩增方法，在等温条件下可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。1技术特点环介导等温扩增技术特点是针对靶序列的6个特异性区域设计两对引物，利用具有链置换... 环介导等温扩增技术（LAMP）是由Notomi等于2000年开发的新颖的恒温核酸扩增方法，在等温条件下可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。1技术特点环介导等温扩增技术特点是针对靶序列的6个特异性区域设计两对引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下30～60分钟，不需要PCR仪即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生。LAMP的扩增效率是目前最高的一种， 展开更多

关键词 扩增技术 等温条件 介导 应用 兽医 DNA聚合酶 恒温条件 扩增方法

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猪捷申病毒荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

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作者 孙志华 林青 +4 位作者 康龙滨 王隆柏 周伦江 俞道进 陈秋勇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期130-133,共4页

为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 mi... 为快速检测猪捷申病毒(PTV),根据PTV 5′UTR基因保守序列设计特异性引物和探针,优化荧光逆转录重组酶介导等温扩增(RT-RAA)反应条件和体系,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床应用对RT-RAA进行评价。结果表明,在37℃恒温反应22 min即可完成对PTV核酸扩增,最低检出限度为30.1 copies/μL;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)均无交叉反应;重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;23份临床样品检测显示PTV阳性率为21.74%(5/23),检测结果与RT-qPCR一致。说明建立的PTV荧光RT-RAA检测方法具有简便、高效、稳定等优点,为PTV的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多

关键词 猪捷申病毒 荧光逆转录重组酶介导等温扩增 检测方法

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基于RAA技术快速检测EHEC-O157型核酸方法的建立

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作者 任宝红 郭瑞 +2 位作者 韩小改 段蕾 贾继民 《食品工程》 2024年第2期72-75,共4页

针对肠出血性大肠埃希氏菌O157型建立一种核酸诊断方法。针对该病原的rfbE基因,利用重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided isothermal amplification,RAA)技术建立检测方法,并做性能评价。该方法在20 min内完成扩增,与多种标准菌... 针对肠出血性大肠埃希氏菌O157型建立一种核酸诊断方法。针对该病原的rfbE基因,利用重组酶介导等温核酸扩增(recombinase aided isothermal amplification,RAA)技术建立检测方法,并做性能评价。该方法在20 min内完成扩增,与多种标准菌株无交叉反应,质粒10 copies/μL或菌液102 CFU/mL可以检出阳性,37℃加压48 h后数据稳定。该方法在特异性、敏感性、稳定性表现良好,可用于肠出血性大肠埃希氏菌O157型检测。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增 O157 rfbE

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十足目虹彩病毒1 RAA-LFD快检方法建立与应用

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作者 田飞焱 吴众怡 +6 位作者 徐节华 黄海莉 裴建明 孟霞 刘文珍 周文华 谢世红 《中国动物检疫》 2025年第2期100-107,共8页

为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的... 为建立一种适用于现场检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的方法,利用DIV1 ATPase编码基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,并结合侧向流试纸条(LFD)技术,通过优化反应时间和温度等条件,建立了可现场检测DIV1的RAA-LFD方法。该方法能够在37℃下恒温反应20 min,并在LFD显色5 min后判读结果;对嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)以及致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(Vp_(AHPND))等虾类病原无交叉反应,仅对DIV1检测呈阳性;最低检测限为5.25×10^(1) copies/反应;组内和组间重复性试验结果良好。使用该方法与已报道的套式PCR和qPCR方法对采集的60份克氏原螯虾样品进行平行检测,检测结果与套式PCR一致,与qPCR方法相比,其敏感性和特异性分别为83.3%和100%。结果表明,该方法反应快速、操作简便、灵敏度高、特异性好,具有良好的重复性和可信度,适用于临床样品的现场检测。 展开更多

关键词 十足目虹彩病毒1 重组酶介导扩增技术 侧流层析技术 恒温扩增 快速检测

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施马伦贝格病毒实时荧光RT-RAA快检方法的建立

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作者 陈嘉仪 黄晓琪 +8 位作者 王炜杰 莫竣喻 王苏艳 丹珍翁姆 陈劲松 张瑞 周泷 李彦敏 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3740-3744,共5页

旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口... 旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲马瘟病毒(AHSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)无交叉反应,其敏感性为103拷贝/反应,且批内和批间重复性变异系数均小于5%。对模拟阳性和阴性绵羊样品的检出率为100%,与SBV的RT-qPCR检测结果一致。本研究成功建立了一种快速、敏感、特异的SBV实时荧光RT-RAA方法,为SBV防控提供新技术手段。 展开更多

关键词 施马伦贝格病毒 重组酶介导核酸恒温扩增方法 快速检测

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口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

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作者 寇美玲 谢佳芮 +5 位作者 李占鸿 张振兴 苏晓航 王轶男 宋建领 苗海生 《中国动物检疫》 CAS 2024年第6期97-102,共6页

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短... 为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组酶介导链置换核酸扩增 侧流层析试纸 恒温扩增 快速检测

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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

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作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA) CRISPR/Cas12系统

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基于RAA-CRISPR/Cas12a快速检测尼帕病毒方法的建立 被引量：2

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作者 徐蛟 王英丽 +5 位作者 王莹 常星 张永强 李金明 包静月 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2023年第10期95-99,111,共6页

本研究建立了一种基于重组酶介导的扩增技术(RAA)以及CRISPR/Cas12a系统快速检测尼帕病毒(NiV)的方法。针对NiV N和F基因分别设计RAA引物和crRNA,构建反应体系,通过前期对引物、crRNA、反应温度以及反应时间等条件筛选优化建立起高效灵... 本研究建立了一种基于重组酶介导的扩增技术(RAA)以及CRISPR/Cas12a系统快速检测尼帕病毒(NiV)的方法。针对NiV N和F基因分别设计RAA引物和crRNA,构建反应体系,通过前期对引物、crRNA、反应温度以及反应时间等条件筛选优化建立起高效灵敏的检测方法,并评估了该方法的敏感性、特异性和重复性。结果显示:建立的方法在37℃恒温条件下,1h即可完成检测,最低检测限能够达到102拷贝/μL,敏感性较高;特异性强,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等常见猪病毒均无交叉反应;稳定性较好,对低、中、高浓度病毒质粒均能成功检出且一致性较好。结果表明,本试验建立的NiV快速检测方法操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好,不需要复杂设备,在蓝光下通过肉眼即可观察结果,可为实现NiV早期快速检测提供有力的技术支持。 展开更多

关键词 重组酶介导扩增技术 CRISPR/Cas12a 尼帕病毒 检测方法

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