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人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：3
1
作者 章卫平 曹雪涛 +3 位作者 王建莉 马施华 黄欣 于益芝 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第3期186-190,共5页
通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤... 通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后．分泌IL-2水平达118.2U／ml；PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段．提示重组逆转录病毒载体已整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础. 展开更多
关键词 人白细胞介素2 重组逆转录病毒载体 构建 表达 基因治疗 肿瘤瘤苗
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HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：1
2
作者 李爱华 刘天承 田竟生 《首都医科大学学报》 CAS 1999年第2期83-85,共3页
通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能... 通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３，细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 展开更多
关键词 HSV1-tk基因 逆转录病毒载体 基因转移 基因重组
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勘误:EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定
3
作者 陈云 周锋 +3 位作者 孙倍成 刘根焰 王冰 姚堃 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期274-274,共1页
因本文作者失误,发表在《细胞与分子免疫学杂志》2009年第25卷第11期第1013-1015页的“EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定”论文中,图2A及图3用错了荧光显微镜和流式细胞术的图像。
关键词 重组逆转录病毒载体 流式细胞术 稳定表达细胞株 荧光显微镜 A基因 《细胞与分子免疫学杂志》
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人 FN cDNA 重组逆转录病毒载体及高表达 FN 肿瘤细胞株的构建
4
作者 张文颖 潘颖 +1 位作者 徐勇 马腾骧 《白求恩医科大学学报》 CSCD 1999年第4期493-495,共3页
目的：探讨 Ｆ Ｎ 对肿瘤细胞生物学行为的影响，将人 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 基因导入低表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｊ中，构建高表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｆ Ｎ。方法：通过 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术，将人全长 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ... 目的：探讨 Ｆ Ｎ 对肿瘤细胞生物学行为的影响，将人 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 基因导入低表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｊ中，构建高表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｆ Ｎ。方法：通过 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术，将人全长 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段插入到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｊ中，经 Ｐ Ａ３１７细胞包装，生产出４代病毒液，感染 Ｎ Ｉ Ｈ３ Ｔ３细胞后，测得假病毒滴度。用高滴度病毒液感染２５３ Ｊ细胞，经４００ μｇ／ｍ ｌ Ｇ４１８筛选，产生抗性克隆。继续传代培养，一步法提取细胞总 Ｒ Ｎ Ａ，进行 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交。结果：２５３ Ｆ Ｎ 细胞除７６ ｋｂ 处显示微弱的内源杂交带以外，在９６ ｋｂ 处有一条较强的杂交带；免疫组化结果显示２５３ Ｆ Ｎ 细胞的胞浆及胞膜均为棕红着色，而２５３ Ｊ细胞和空载体转染细胞仅轻微着色。结论：转染后的细胞染色体中成功地整合了 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段，并能够在转录水平和蛋白水平表达。从而建立了高表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株，为深入研究肿瘤的转移机理奠定了基础。 展开更多
关键词 纤维粘连蛋白 逆转录病毒载体 肿瘤细胞株 表达
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蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达 被引量：1
5
作者 周兴 张居农 《中国奶牛》 2007年第S1期116-119,共4页
构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染... 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后收集病毒上清感染NIH_3T_3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×10~4CFU/mL。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。 展开更多
关键词 蚓激酶 重组逆转录病毒 包装 转染 表达
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人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达
6
作者 王轩 李希 +2 位作者 刘福坤 黎介寿 徐根兴 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期693-697,共5页
　为探讨转人血管内皮抑制基因(endostatin)在转染细胞中的表达,利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒,通过脂质体(lipofectamine)将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液.用重组病毒液感染NIH3T3细胞,经G418筛选获... 　为探讨转人血管内皮抑制基因(endostatin)在转染细胞中的表达,利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒,通过脂质体(lipofectamine)将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液.用重组病毒液感染NIH3T3细胞,经G418筛选获得转人endostatin基因细胞株NIH3T3＿endo.同法制备对照细胞株NIH3T3＿pLncx.PCR检测NIH3T3＿endo细胞基因组,在扩增产物中有一550bp人endostatin基因特异性片段,对照组为阴性.免疫组化测定示仅NIH3T3＿endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达.说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞,并获得稳定表达. 展开更多
关键词 人endostatin基因组 血管内皮抑制素 重组逆转录病毒 NIH3T3细胞 基因重组 基因表达 载体构建 抗肿瘤血管疗法
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人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达 被引量：7
7
作者 陈永井 施勤 +5 位作者 葛彦 徐宽枫 古涛 孙建军 李文香 张学光 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第2期110-114,共5页
目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93... 目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 PD-L1 基因克隆 逆转录病毒载体 构建 稳定表达
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达 被引量：9
8
作者 傅建新 王玮 +2 位作者 卢大儒 岑建农 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期261-265,共5页
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交... 逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 基因表达 构建
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绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：7
9
作者 刘德莉 胡晓洁 +2 位作者 吴娟娟 刘伟 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期424-425,438,共3页
目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细... 目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论　构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。 展开更多
关键词 重组逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 细胞标记 GFP
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人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用 被引量：5
10
作者 章卫平 曹雪涛 +4 位作者 马施华 黄欣 张明徽 陶群 叶天星 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第1期26-32,共7页
利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包... 利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 人G-CSF基因 克隆 重组逆转录病毒载体 构建 应用 粒细胞集落刺激因子 基因治疗
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人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定 被引量：3
11
作者 贺伟峰 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 马兵 雷晓 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期782-785,共4页
目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果　成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 CTLA4IG基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒 双基因共表达 基因重组 脂质体法 增强型绿色荧光蛋白
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PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究 被引量：5
12
作者 闫国和 杨余亮 +6 位作者 侯爱莲 王锋超 许庆娥 熊玮 程天民 王军平 粟永萍 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第21期2024-2028,共5页
目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bM... 目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 血小板衍生生长因子A链基因 骨髓间充质干细胞 稳定表达
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正反义人端粒酶RNA组分(hTR)逆转录病毒真核表达载体的构建 被引量：5
13
作者 王丛笑 刘吉勇 +3 位作者 赵跃然 焦玉莲 马春燕 杨崇美 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2005年第1期51-51,共1页
端粒的功能是完成染色体末端的复制,防止染色体免遭融合、重组和降解,其长度的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础,而调控端粒长度的关键分子则是端粒酶.端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用.端粒酶RNA(hTR)... 端粒的功能是完成染色体末端的复制,防止染色体免遭融合、重组和降解,其长度的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础,而调控端粒长度的关键分子则是端粒酶.端粒酶的重新表达在细胞永生化及癌变过程中起着重要的作用.端粒酶RNA(hTR) 作为端粒酶的组成部分决定着端粒的重复序列并参与端粒酶的活化.本研究将反义端粒酶RNA基因插入到逆转录病毒质粒载体PLXSN中,构建真核表达重组质粒PLXSN-hTR,以期重组质粒表达反义端粒酶RNA,从复制、转录、及翻译三个水平发挥作用,调控肿瘤细胞的端粒长度和端粒酶的活性,抑制或逆转肿瘤细胞的恶性表型,为研究和探索基因治疗肿瘤奠定基础. 展开更多
关键词 反义人端粒酶RNA组分 真核表达载体 逆转录病毒 细胞永生化 分子基础 恶性转化 端粒长度 癌变过程 重复序列 染色体
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反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定 被引量：4
14
作者 段德义 张海燕 +2 位作者 徐群渊 李颖 杨慧 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期103-107,共5页
为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行... 为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。 展开更多
关键词 反义HLA-A2 GDNF 基因表达 逆转录病毒载体 PARKINSON病 神经退行性疾病 人成纤维细胞 基因治疗
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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：3
15
作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页
本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多
关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞 稳定表达
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骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：3
16
作者 祝联 刘伟 +5 位作者 陈兵 刘德莉 刘方军 吴娟娟 陆俊弘 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期329-331,共3页
目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化... 目的 :实现骨形成蛋白 7(BMP 7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法 :构建重组BMP 7逆转录病毒表达载体。通过PT6 7包装细胞克隆 ,嘌呤霉素筛选、扩增 ,获得含BMP 7基因的逆转录病毒液 ,直接感染骨髓基质干细胞 ,用免疫组化方法检测BMP 7的表达。结果 :成功地构建了重组BMP 7逆转录病毒表达载体 ,并可在骨髓基质干细胞中表达BMP 7。结论 :重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP 7,为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组逆转录病毒载体 骨形成蛋白—7 组织工程 骨髓基质干细胞
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蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达
17
作者 周兴 张居农 《草食家畜》 2007年第1期17-20,共4页
构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA... 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/ml。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,也就是说蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。 展开更多
关键词 蚓激酶 重组逆转录病毒 包装 转染 表达
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含LacZ重组逆转录病毒的制备及其在NIH_3T_3细胞的表达 被引量：1
18
作者 王凤阳 孟庆文 +4 位作者 扈荣良 池海英 张茂林 于康震 殷震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期329-331,共3页
构建了含有 3.7kbLacZ的重组逆转录病毒载体 ,转染包装细胞系PA317后 ,经G418筛选 ,得到了G418抗性的产毒细胞系 ,用收获的含有重组逆转录病毒粒子的浓缩病毒上清 ,感染NIH3T3细胞 ,经X_gal染色检测 ,发现表达了LacZ的NIH3T3细胞呈蓝色。
关键词 重组逆转录病毒 LACZ NIH3T3细胞 基因表达 外源基因 转基因
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缺氧调控表达的NT-3逆转录病毒载体的构建及鉴定 被引量：1
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作者 张军峰 史利利 +5 位作者 张力 杨蓬勃 张建水 刘勇 祁存芳 徐曦 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期190-194,共5页
目的构建与鉴定含有5个拷贝缺氧反应元件（five copies of hypoxia responsive elements,5HRE）的缺氧调控表达的神经营养因子-3（neurotrophin-3,NT-3）的逆转录病毒载体。方法用PCR、酶切和连接等分子克隆技术将5HRE和人来源NT-3片段... 目的构建与鉴定含有5个拷贝缺氧反应元件（five copies of hypoxia responsive elements,5HRE）的缺氧调控表达的神经营养因子-3（neurotrophin-3,NT-3）的逆转录病毒载体。方法用PCR、酶切和连接等分子克隆技术将5HRE和人来源NT-3片段克隆入逆转录病毒载体pLNCX中,构建重组逆转录病毒穿梭质粒pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP。经PT67包装细胞包装、高速离心纯化和浓缩等方法,获得逆转录病毒RV-5HRE-NT3;用逆转录病毒感染NIH 3T3细胞48h后,流式细胞仪检测并计算出病毒滴度。结果成功构建了重组逆转录病毒载体质粒pLNCX-5HRE-SV40-NT3-IRES-EGFP,并获得相应的逆转录病毒RV-5HRE-NT3,经过高速离心纯化和浓缩后,其滴度可达9.1×10~6 cfu/mL。结论成功构建了缺氧调控表达的NT-3逆转录病毒载体,为研究外源基因的缺氧调控特异性表达奠定了工作基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 缺氧调控表达 神经营养因子-3
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逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达 被引量：1
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作者 欧阳立明 周涛 +2 位作者 薛冲 刘志敏 张嗣良 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期55-58,共4页
为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主... 为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 . 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 人神经营养因子-3 基因治疗 基因表达 大鼠成纤维细胞
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