趋化因子受体CXCR4反义RNA重组表达载体的构建及其在真核细胞中的表达 被引量：2

1

作者 邢卉春 徐小元 +4 位作者 王勤环 于敏 公伟波 斯崇文 邵一鸣 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期155-158,共4页

目的 :构建趋化因子受体CXCR4反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV 1研究。方法 :用RT PCR法从健康人外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMCs)中获得目的基因 ,并以正、反两个方向定向插入到逆转录... 目的 :构建趋化因子受体CXCR4反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV 1研究。方法 :用RT PCR法从健康人外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMCs)中获得目的基因 ,并以正、反两个方向定向插入到逆转录病毒载体 pLXSN。重组载体用脂质体转染剂 (lipofectAMINE)转染PA317包装细胞 ,抗G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR(fluorogenic quantitativePCR ,FQ PCR)测定假病毒滴度 ,进一步感染NIH 3T3细胞。结果 :CXCR4正、反义RNA的真核表达载体 ,经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH 3T3细胞 ,目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 :从PBMCs中获得的目的基因通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达 ,为进一步研究CXCR4反义RNA的抗HIV 1作用奠定了基础。 展开更多

关键词 趋化因子受体 CXCR4反义RNA重组表达载体 构建 真核细胞 表达

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靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

2

作者 杨义明 刘预 +1 位作者 涂植光 张钰倩 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期503-506,共4页

目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构... 目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用。COX-2mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%。结论成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达。 展开更多

关键词 环氧化酶-2 短发夹RNA 重组表达载体

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大鼠SLPI基因siRNA重组表达载体构建及其在调控真皮多能干细胞增殖中的作用 被引量：1

3

作者 蔡俊 屈纪富 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期356-360,共5页

目的观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用。方法酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs。在前期成功构建SLPI基因过表... 目的观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用。方法酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs。在前期成功构建SLPI基因过表达载体基础上,根据SLPI基因si RNA的设计挑选出最佳抑制SLPI基因表达的干扰载体,RT-PCR、Western blot鉴定。重组表达载体转染DMSCs,观察其表达,运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,观察SPLI基因促进DMSCs的增殖作用。结果成功分离获得真皮来源、具有细胞干性的DMSCs;并成功构建SLPI基因过表达真核载体及SLPI基因si RNA表达载体,转染DMSCs(分为过表达组和干扰组,并以转染空载体者为对照组)。CCK-8检测显示,48、72、96 h,过表达组增殖较快,干扰组增殖较慢,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);72、96 h,过表达组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明过表达组增殖较快,即SLPI基因有促进增殖作用。流式细胞检测表明,过表达组G1期与干扰组比较差异有统计学意义(P<0.05),S期、G2期与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SLPI基因具有明确的促DMSCs增殖作用,促进细胞从G1向S和G2期转变,即通过调控细胞周期发挥促增殖作用。 展开更多

关键词 分泌型白细胞蛋白酶抑制因子 重组表达载体 真皮多能干细胞 增殖

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人乳头瘤病毒58型L1基因重组表达载体的构建及鉴定

4

作者 肖鹏 谷鸿喜 +3 位作者 李迪 魏兰兰 庄敏 凌虹 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第2期64-64,共1页

关键词 人乳头瘤病毒58型 L1基因 重组表达载体 构建 鉴定

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重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应 被引量：4

5

作者 杨欣伟 隋延仿 +5 位作者 李增山 曲萍 叶菁 武文 董海龙 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期443-446,共4页

目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。... 目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。 展开更多

关键词 重组SEA基因真核表达载体 肝癌 超抗原 肝癌 CTL 免疫效应 动物实验

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重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究 被引量：8

6

作者 黄波 冯作化 +1 位作者 张桂梅 李东 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第3期168-172,共5页

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 1... 目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。 展开更多

关键词 pCH510质粒 基因转染 化疗 肿瘤 小鼠 重组FN多肽真核表达载体

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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建 被引量：2

7

作者 朱建中 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期453-454,共2页

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中... 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 人疱疹病毒8型 K12基因 重组真核表达载体 构建

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抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

8

作者 何颖 黄力 +3 位作者 章亚男 黎怀星 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期55-57,共3页

目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,... 目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,然后以克隆出的小鼠 Ig G重链区 c DNA为模板 ,用 PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和 Ig G重链区基因融合在一起的序列 ,并插入到 p VAX质粒载体中。结果 :扩增出来的 4种不同组合的抗原表位基因和 Ig G重链区基因融合序列大小分别为 999、1 0 2 0、1 0 0 5、1 0 2 6 bp,均与 Gen Bank上登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序亦显示抗原表位基因和 Ig G重链区基因为所需基因 ,接头序列也完全正确。结论 :成功构建了抗阿尔茨海默病的 4种表位基因 - Ig G重链区融合表达的重组质粒 。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 重组真核表达载体 抗原 基因序列 基因表达

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hBSP与GFP非融合表达载体的构建及乳腺癌细胞转染条件优化 被引量：2

9

作者 杜红延 王捷 +3 位作者 郭勇 郑霖 杨静 刘大志 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第11期46-50,共5页

为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的... 为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和流式细胞仪筛选获得稳定转染细胞.结果发现:在96孔板中,细胞融合度达到90%;用1μg脂质体介导280 ng重组质粒转染10 h,转染效率最高可达(19.70±1.10)%. 展开更多

关键词 骨唾液蛋白 荧光蛋白 重组表达载体 乳腺癌细胞 转染 优化

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定点突变对BPI_(23)-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响 被引量：4

10

作者 安云庆 柯岩 +1 位作者 靖学芳 杨贵贞 《首都医科大学学报》 CAS 2002年第3期197-201,共5页

为提高BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率 ,采用定点突变法改造 pBV BPI60 0 Fcγ1 70 0 重组表达载体 ,转化E .coliDH5α后 ,通过温控诱导表达。结果表明 :①突变后BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前... 为提高BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率 ,采用定点突变法改造 pBV BPI60 0 Fcγ1 70 0 重组表达载体 ,转化E .coliDH5α后 ,通过温控诱导表达。结果表明 :①突变后BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前提高约 1 0 % ;②表达时间提前约 1h ;③抗菌活性未受影响 ; 展开更多

关键词 定点突变 pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体 BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白

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人类核糖核酸酶9基因的克隆及表达载体的构建 被引量：1

11

作者 程桂芝 李芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期748-750,共3页

目的:构建人类核糖核酸酶9(human ribonuc lease9,hRNase9)的重组表达载体。方法:从成年人附睾组织提取了总RNA,通过RT-PCR扩增了hRNase9编码成熟肽的基因片段,将其克隆入载体pET25b(+)的NdeI和EcoRI位点之间,构建了重组表达载体pET25b(... 目的:构建人类核糖核酸酶9(human ribonuc lease9,hRNase9)的重组表达载体。方法:从成年人附睾组织提取了总RNA,通过RT-PCR扩增了hRNase9编码成熟肽的基因片段,将其克隆入载体pET25b(+)的NdeI和EcoRI位点之间,构建了重组表达载体pET25b(+)-hRNase9,并通过PCR法、限制性内切酶消化法和DNA序列测定加以证实,以IPTG诱导重组载体转化宿主菌E.coliBL21(DE3)表达重组hRNase9蛋白。结果:重组载体pET25b(+)-hRNase9构建成功,SDS-PAGE显示重组载体转化宿主菌E.coliBL21(DE3)表达了Mr约为21000的重组hRNase9蛋白。结论:成功的扩增了hRNase9编码成熟肽的基因片段,构建了重组表达载体pET25b(+)-hRNase9,为下一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 人类核糖核酸酶9 基因克隆 重组表达载体

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鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达 被引量：1

12

作者 李仙春 芦艳 +4 位作者 毛耀芳 杨海峰 余海山 马永华 万学瑞 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第12期2138-2146,共9页

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp... 试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-Ch Prnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。 展开更多

关键词 鸡 Prnp基因 重组表达载体 原核表达

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pRluc-hKOR-pcDNA3.1真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达 被引量：4

13

作者 李雅林 白波 +3 位作者 陈京 刘有旺 刘海青 路海 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期2078-2080,共3页

目的:构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法:以质粒pcD-NA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KO... 目的:构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法:以质粒pcD-NA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR。扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1。然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney293,HEK293)细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察。结果:扩增出了1条约1.2kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank(NM_000912)中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上。结论:构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用。 展开更多

关键词 受体 阿片样 κ 重组真核表达载体 HEK293细胞

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HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

14

作者 何秀霞 于源华 +1 位作者 张春兰 荀恒杰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期631-633,共3页

目的：构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法：采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将... 目的：构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法：采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩ-TE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩ-T7SE。将pTΩ-T7SE转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导后用Western blot鉴定融合蛋白。结果：获得全长为1284bp的融合的HBV/HEV的基因片段。已构建的重组质粒pTΩ-T7SE转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约为50000重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%。Western blot结果表明在Mr为50000处可见特异性着色带。结论：成功构建了原核表达载体pTΩ-T7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。 展开更多

关键词 HBV HEV 重组原核表达载体 二价疫苗

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O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达 被引量：1

15

作者 李淑萍 孙世琪 +2 位作者 莫亚霞 胡永浩 郭慧琛 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期1-6,共6页

为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3... 为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增后进行酶切,用T4连接酶连接得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3。对重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3进行PCR鉴定并测序。用脂质体将重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)及Western blot检测重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中得到表达。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组真核表达载体 pVAX-VP0VP1VP3构建和表达 病毒样颗粒

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嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建 被引量：1

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作者 杜瑞琴 白云 +1 位作者 黎万玲 姜曼 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期48-51,共4页

目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5... 目的　构建嵌合跨膜型CD5 5基因的重组逆病毒表达质粒。方法　采用PCR技术扩增编码CD5 5信号肽及成熟蛋白胞外区 (-3 4 -3 0 4aa)的DNA片段 ,双侧引入EcoRⅠ、SspⅠ位点 ,与编码CD46分子的跨膜区及膜内区 (2 70～ 3 5 0aa)的DNA片段的5’末端自身的StuI位点连接 ,构建嵌合跨膜型CD5 5DNA片段 ,序列测定后将此嵌合CD5 5片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒 ,酶切鉴定插入片段的方向。结果　DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5DNA阅读框完整、连接部位序列正确 ;HindⅢ酶切鉴定得到了正向插入的CD5 5TM pLXSN重组表达质粒。结论　我们成功构建了嵌合跨膜型CD5 5DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD5 5TM pLXSN ,为进一步在真核细胞中表达嵌合分子 ,比较研究GPI锚固型CD5 5分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。 展开更多

关键词 嵌合跨膜型分子 重组逆转录病毒表达载体 CD55基因 质粒

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SOX9腺病毒过表达载体的构建及其对犬ADSCs向胰岛样细胞分化的影响

17

作者 高登科 戴鹏秀 +5 位作者 范志新 张霞 阮晨梅 王璟璐 张欣珂 张翊华 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第1期1-5,I0002,I0003,共7页

脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞。SOX9是胰腺发育调控网络中的多潜能因子,其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭。但到目前为止,SOX9在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中是否... 脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞。SOX9是胰腺发育调控网络中的多潜能因子,其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭。但到目前为止,SOX9在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中是否具有重要作用尚不完全清楚。本试验构建了腺病毒过表达重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy,并获得了具有感染性的腺病毒毒液,将其感染犬ADSCs,感染后4、7、10、13 d和16 d观察绿色荧光蛋白表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,过表达SOX 9基因的腺病毒毒液感染犬ADSCs后,出现绿色荧光蛋白表达;并在第13天细胞开始出现聚集生长现象,在第16天出现多个似胰岛样细胞团;同时检测到SOX9可外源性刺激Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK 1和PCSK 2等基因的内源性表达。表明SOX 9基因过表达腺病毒毒液可成功感染犬ADSCs,促进其向胰岛样细胞分化。 展开更多

关键词 SOX9基因 腺病毒过表达重组载体 犬ADSCs 胰岛样细胞

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金针菇免疫调节蛋白FIP-fve在毕赤酵母中的表达研究

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作者 杜婉嘉 陈香利 +3 位作者 毛雪 马银鹏 孔祥辉 林火松 《食药用菌》 2024年第3期176-181,共6页

金针菇免疫调节蛋白FIP-fve是隶属于真菌免疫调节蛋白家族的小分子功能蛋白质,在生物医学研究和功能食品应用中有重要价值,但天然蛋白产量较低。本文构建了真核表达载体pPIC9K-FIP-fve后转入毕赤酵母GS115。结果:甲醇诱导获得高效分泌... 金针菇免疫调节蛋白FIP-fve是隶属于真菌免疫调节蛋白家族的小分子功能蛋白质,在生物医学研究和功能食品应用中有重要价值,但天然蛋白产量较低。本文构建了真核表达载体pPIC9K-FIP-fve后转入毕赤酵母GS115。结果:甲醇诱导获得高效分泌表达的可溶性蛋白,表达率40%以上,经纯化,蛋白产率为121.6 mg/L。本研究为FIP-fve重组蛋白应用奠定了基础。 展开更多

关键词 金针菇免疫调节蛋白 真核重组载体构建与表达 纯化

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弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达 被引量：3

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作者 孙玲 刘慧颖 +3 位作者 李淑红 宫鹏涛 张西臣 宁静 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期631-635,共5页

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基... 目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质粒PET-28a-GRA1,转化E.coli BL21,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:克隆的GRA1基因与GenBank收录的基因序列同源性为100%。对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得573bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-GRA1。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白条带的相对分子质量约为24 000,Western blotting显示重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论:成功获取GRA1基因,构建了PET-28a-GRA1重组质粒并获得了高效表达。 展开更多

关键词 GRA1基因 原核表达载体 弓形虫 克隆 GRAl SDS-PAGE BLOTTING 重组表达载体

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PcDNA3.1-rhGM-CSF表达质粒的构建及其对K562细胞生长与分化的影响作用 被引量：2

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作者 朱红 杨晓红 +1 位作者 王亚平 唐恩洁 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期494-497,502,共5页

目的:观察GM-CSF对髓系白血病细胞(K562)生长、分化的影响作用。方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体中,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体。经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定确认,转染人K... 目的:观察GM-CSF对髓系白血病细胞(K562)生长、分化的影响作用。方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体中,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体。经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定确认,转染人K562髓系白血病细胞、72小时后采用细胞形态学检测、MTT试验、免疫组化技术观察和分析PcD-NA3.1-rhGM-CSF在K562细胞中的表达及其影响该细胞生长与分化的作用。结果:①成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;②重组质粒PcDNA3.1-rhGM-CSF能在K562细胞中表达,并诱导K562细胞向单核细胞系、巨噬细胞系分化;③K562细胞增殖受到明显抑制。结论:成功构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;转染K562细胞能向单核细胞系、巨噬细胞系分化。 展开更多

关键词 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 重组表达载体 细胞分化 K562

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