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脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长
被引量：
2
1
作者
曹汝菲
李泽轩
+4 位作者
许欢
张莎
张敏敏
戴枫
段晓雷
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第9期180-190,共11页
获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-f...
获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-flow技术检测纯化蛋白的活性;使用结晶机器人及多种试剂盒进行结晶条件筛选与优化培养,并进行初步的X射线衍射分析。获得高纯度(>98.5%)与高浓度(17 mg/mL)的B.f Pif1蛋白,动力学结果显示其解旋活性良好。结晶实验表明:在0.1 mol/L Bis-Tris乙酸(pH 8.3),0.05 mol/L碳酸氢钠,5%甘油和0.015 mol/L亚精胺条件下培养出形态较好的单晶,其X射线衍射分辨率达到3.5?。成功表达纯化与结晶培养出具有较高分辨率的B.f Pif1蛋白的单晶。
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关键词
Pif1解旋酶
脆弱拟杆菌
重组表达纯化
蛋白结晶
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职称材料
人源SOD1及其突变体的表达纯化及酶学性质
被引量：
1
2
作者
杨方瑶
简甜甜
+2 位作者
蒋立翔
张钰
黄新河
《生物学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第2期20-26,共7页
分析人源SOD1(hSOD1)、牦牛SOD1序列,定点突变得到hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)和Mt2SOD1(I18T、N20H、K31V、C112S),全合成经密码子优化的hSOD1、Mt1SOD1、Mt2SOD1、牦牛SOD1序列后,将其重组克隆到表达载体pET-28a(+)...
分析人源SOD1(hSOD1)、牦牛SOD1序列,定点突变得到hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)和Mt2SOD1(I18T、N20H、K31V、C112S),全合成经密码子优化的hSOD1、Mt1SOD1、Mt2SOD1、牦牛SOD1序列后,将其重组克隆到表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。重组菌经1 mmol/L IPTG诱导,在含800μmol/L Cu^(2+)和20μmol/L Zn^(2+)的LB培养基中,25℃、180 r/min诱导培养16 h,4种SOD1均以可溶性形式高效表达,镍亲和层析可有效纯化重组SOD1。100 mL LB摇瓶培养获得的hSOD1活性为71094 U/mg,产率为4.57 mg。Mt1SOD1活性为128506 U/mg,产率为3.13 mg。Mt2SOD1活性为58700.1 U/mg,产率为5.47 mg。牦牛SOD1活性为42969.5 U/mg,产率为6.81 mg。对hSOD1、Mt1SOD1的酶学性质研究表明,在25℃~55℃,酶活力基本保持不变,75℃保温30 min,hSOD1相对酶活力保持在50%左右,Mt1SOD1保持30%酶活性。在pH 3.6~10.4条件下放置30 min,两种SOD1均能保持70%以上的酶活力。研究通过定点突变获得高活性高稳定性的hSOD1和Mt1SOD1,为SOD1在医疗、保健、化妆品等领域的应用奠定基础。
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关键词
铜锌超氧化物歧化酶
大肠杆菌
定点突变
重组
表达
与
纯化
活性
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职称材料
日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化
被引量：
3
3
作者
冯猜
周娜娜
+2 位作者
孙世宇
周洁羽
孙威
《西北植物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第6期926-932,共7页
二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质...
二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。
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关键词
日本蛇根草
二氢黄酮醇4-还原酶
基因克隆
重组
蛋白
表达
与
纯化
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职称材料
题名
脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长
被引量：
2
1
作者
曹汝菲
李泽轩
许欢
张莎
张敏敏
戴枫
段晓雷
机构
遵义医科大学生物化学教研室
遵义医科大学检验医学院
西北农林科技大学生命科学学院
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第9期180-190,共11页
基金
国家自然科学基金项目(31660241)
贵州省科技厅基础研究项目(黔科合基础[2018]1196)
+2 种基金
贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwjkj2019-1-196)
遵义医学院附属医院博士科研启动资金[院字(2017)05号]
大学生创新创业训练计划(ZYDC2019050,20195201901)。
文摘
获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-flow技术检测纯化蛋白的活性;使用结晶机器人及多种试剂盒进行结晶条件筛选与优化培养,并进行初步的X射线衍射分析。获得高纯度(>98.5%)与高浓度(17 mg/mL)的B.f Pif1蛋白,动力学结果显示其解旋活性良好。结晶实验表明:在0.1 mol/L Bis-Tris乙酸(pH 8.3),0.05 mol/L碳酸氢钠,5%甘油和0.015 mol/L亚精胺条件下培养出形态较好的单晶,其X射线衍射分辨率达到3.5?。成功表达纯化与结晶培养出具有较高分辨率的B.f Pif1蛋白的单晶。
关键词
Pif1解旋酶
脆弱拟杆菌
重组表达纯化
蛋白结晶
Keywords
Pif1 helicase
Bacteroides fragilis
recombinant expression and purification
protein crystallization
分类号
Q936 [生物学—微生物学]
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职称材料
题名
人源SOD1及其突变体的表达纯化及酶学性质
被引量：
1
2
作者
杨方瑶
简甜甜
蒋立翔
张钰
黄新河
机构
西南交通大学生命科学与工程学院
出处
《生物学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第2期20-26,共7页
基金
中央高校基本科研业务费项目(No.2682020ZT97)
大学生科研创新训练计划项目(No.202010613061)。
文摘
分析人源SOD1(hSOD1)、牦牛SOD1序列,定点突变得到hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)和Mt2SOD1(I18T、N20H、K31V、C112S),全合成经密码子优化的hSOD1、Mt1SOD1、Mt2SOD1、牦牛SOD1序列后,将其重组克隆到表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。重组菌经1 mmol/L IPTG诱导,在含800μmol/L Cu^(2+)和20μmol/L Zn^(2+)的LB培养基中,25℃、180 r/min诱导培养16 h,4种SOD1均以可溶性形式高效表达,镍亲和层析可有效纯化重组SOD1。100 mL LB摇瓶培养获得的hSOD1活性为71094 U/mg,产率为4.57 mg。Mt1SOD1活性为128506 U/mg,产率为3.13 mg。Mt2SOD1活性为58700.1 U/mg,产率为5.47 mg。牦牛SOD1活性为42969.5 U/mg,产率为6.81 mg。对hSOD1、Mt1SOD1的酶学性质研究表明,在25℃~55℃,酶活力基本保持不变,75℃保温30 min,hSOD1相对酶活力保持在50%左右,Mt1SOD1保持30%酶活性。在pH 3.6~10.4条件下放置30 min,两种SOD1均能保持70%以上的酶活力。研究通过定点突变获得高活性高稳定性的hSOD1和Mt1SOD1,为SOD1在医疗、保健、化妆品等领域的应用奠定基础。
关键词
铜锌超氧化物歧化酶
大肠杆菌
定点突变
重组
表达
与
纯化
活性
Keywords
Cu/Zn superoxide dismutase
Escherichia coli
site-directed mutagenesis
recombinant expression and purification
activity
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
Q55 [生物学—生物化学]
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职称材料
题名
日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化
被引量：
3
3
作者
冯猜
周娜娜
孙世宇
周洁羽
孙威
机构
贵州师范大学生命科学学院/植物生理与发育调控重点实验室
西南喀斯特山地生物多样性保护重点实验室
出处
《西北植物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第6期926-932,共7页
基金
国家自然科学基金(31760076)
贵州省科技计划(黔科合平台人才[2017]5726号)
+2 种基金
贵州省科技厅基础研究项目(黔科合基础[2018]1011)
喀斯特山地生态安全工程研究中心(黔教合KY字[2021]007)
贵州省教育厅特色领域项目(黔教合KY字[2021]059)。
文摘
二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。
关键词
日本蛇根草
二氢黄酮醇4-还原酶
基因克隆
重组
蛋白
表达
与
纯化
Keywords
Ophiorrhiza japonica
dihydroflavonol 4-reductase
gene cloning
expression and purification of recombinant protein
分类号
Q785 [生物学—分子生物学]
Q784 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长
曹汝菲
李泽轩
许欢
张莎
张敏敏
戴枫
段晓雷
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
2
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职称材料
2
人源SOD1及其突变体的表达纯化及酶学性质
杨方瑶
简甜甜
蒋立翔
张钰
黄新河
《生物学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2023
1
在线阅读
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职称材料
3
日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化
冯猜
周娜娜
孙世宇
周洁羽
孙威
《西北植物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
3
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职称材料
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