目的:构建尤文肉瘤融合基因EWS-FLI1重组腺病毒,利用此腺病毒感染外周血单核细胞(PBMC),培养树突细胞(DC),检测感染后的DC致敏的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用。方法:将质粒Pec1/EW S-FLI1酶切,切出的EWS-FLI1 cDNA片段克隆至腺...目的:构建尤文肉瘤融合基因EWS-FLI1重组腺病毒,利用此腺病毒感染外周血单核细胞(PBMC),培养树突细胞(DC),检测感染后的DC致敏的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用。方法:将质粒Pec1/EW S-FLI1酶切,切出的EWS-FLI1 cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv的hCMV启动子下游。将穿梭质粒和骨架质粒共同转化大肠杆菌B J5183菌株,获得同源重组后的腺病毒质粒pADeasy-1/EW S-FLI1。将此质粒转染293细胞,包装产生腺病毒Ad EW S-FLI1。扩增、纯化产生高滴度的Ad EW S-FLI1。转染PBMC并经过鉴定后致敏淋巴细胞,4 h51Cr释放试验测定致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用。结果:同源重组后产生的pADeasy-1/EW S-FLI1经PCR鉴定构建成功,纯化后的滴度为4×1010/mL。转染PBMC后,RT-PCR证实有EW S-FLI1 mRNA的转录。致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系有明显的杀伤作用,效靶比在40∶1时,对尤文肉瘤673细胞系的杀伤率为35.1800%±0.0128%,和对照组相比差异有统计学意义。结论:重组腺病毒Ad EW S-FLI1构建成功,并能在PBMC中稳定有效地表达,Ad EW S-FLI1转染的DC可高效地诱发机体T细胞的特异性抗肿瘤免疫应答作用。展开更多
目的:建立一种简便快捷的分离纯化肾病患者尿IgG亚类的方法。方法:收集的肾病患者24h尿液经硫酸铵盐析、DEAE-cellu lose离子交换层析和葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析等3步分离纯化,即可得到IgG1、IgG2、IgG3、IgG44种亚类,最后用W estern...目的:建立一种简便快捷的分离纯化肾病患者尿IgG亚类的方法。方法:收集的肾病患者24h尿液经硫酸铵盐析、DEAE-cellu lose离子交换层析和葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析等3步分离纯化,即可得到IgG1、IgG2、IgG3、IgG44种亚类,最后用W estern b lotting和SDS-PAGE电泳的方法鉴定样品及其纯度。结果:SPA亲和层析洗脱曲线显示有4个独立的洗脱峰,W estern b lotting和SDS-PAGE方法鉴定表明提纯的样品为高纯度的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。结论:本方法通过3步即可一次性将样品中的4种不同的IgG亚类全部分离纯化,且纯度高,简便快捷,效果良好。展开更多
文摘目的:构建尤文肉瘤融合基因EWS-FLI1重组腺病毒,利用此腺病毒感染外周血单核细胞(PBMC),培养树突细胞(DC),检测感染后的DC致敏的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用。方法:将质粒Pec1/EW S-FLI1酶切,切出的EWS-FLI1 cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv的hCMV启动子下游。将穿梭质粒和骨架质粒共同转化大肠杆菌B J5183菌株,获得同源重组后的腺病毒质粒pADeasy-1/EW S-FLI1。将此质粒转染293细胞,包装产生腺病毒Ad EW S-FLI1。扩增、纯化产生高滴度的Ad EW S-FLI1。转染PBMC并经过鉴定后致敏淋巴细胞,4 h51Cr释放试验测定致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用。结果:同源重组后产生的pADeasy-1/EW S-FLI1经PCR鉴定构建成功,纯化后的滴度为4×1010/mL。转染PBMC后,RT-PCR证实有EW S-FLI1 mRNA的转录。致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系有明显的杀伤作用,效靶比在40∶1时,对尤文肉瘤673细胞系的杀伤率为35.1800%±0.0128%,和对照组相比差异有统计学意义。结论:重组腺病毒Ad EW S-FLI1构建成功,并能在PBMC中稳定有效地表达,Ad EW S-FLI1转染的DC可高效地诱发机体T细胞的特异性抗肿瘤免疫应答作用。
文摘目的:建立一种简便快捷的分离纯化肾病患者尿IgG亚类的方法。方法:收集的肾病患者24h尿液经硫酸铵盐析、DEAE-cellu lose离子交换层析和葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析等3步分离纯化,即可得到IgG1、IgG2、IgG3、IgG44种亚类,最后用W estern b lotting和SDS-PAGE电泳的方法鉴定样品及其纯度。结果:SPA亲和层析洗脱曲线显示有4个独立的洗脱峰,W estern b lotting和SDS-PAGE方法鉴定表明提纯的样品为高纯度的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。结论:本方法通过3步即可一次性将样品中的4种不同的IgG亚类全部分离纯化,且纯度高,简便快捷,效果良好。
