恶性疟原虫反义HRPⅡ基因荧光真核表达重组质粒的构建

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作者 方建民 余新炳 +3 位作者 叶苓 徐劲 吴忠道 李学荣 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第3期9-11,共3页

目的　构建恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )反义真核表达载体 ,为研究HRPⅡ反义核酸的抗疟作用奠定基础。方法　应用基因重组技术 ,将我们已经克隆的恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19反向亚克隆入荧光... 目的　构建恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )反义真核表达载体 ,为研究HRPⅡ反义核酸的抗疟作用奠定基础。方法　应用基因重组技术 ,将我们已经克隆的恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19反向亚克隆入荧光真核表达载体pEGFP N3,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌 ,阳性重组子经HindⅢ和SacⅠ双酶切分析、PCR鉴定。结果　恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19重组质粒中 ,成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP N3,获得了反义HRPⅡ /pUC19重组质粒。结论　恶性疟原虫HRPⅡ基因以反方向亚克隆入pEGFP N3质粒 ,成功构建反义HRPⅡ /pEGFP N3荧光真核表达载体 ,解决了HRPⅡ反义核酸来源问题 ,为下一步研究反义HPRⅡ的抗疟作用奠定了基础。 展开更多

关键词 恶性疟原虫 荧光真核 反义HRPⅡ基因 重组质粒

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pRluc-hKOR-pcDNA3.1真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达 被引量：4

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作者 李雅林 白波 +3 位作者 陈京 刘有旺 刘海青 路海 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期2078-2080,共3页

目的:构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法:以质粒pcD-NA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KO... 目的:构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法:以质粒pcD-NA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR。扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1。然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney293,HEK293)细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察。结果:扩增出了1条约1.2kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank(NM_000912)中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上。结论:构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用。 展开更多

关键词 受体 阿片样 κ 重组真核表达载体 HEK293细胞

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重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk的构建及在细胞内的热诱导表达 被引量：1

3

作者 唐秋莎 陈道桢 张东生 《医学研究生学报》 CAS 2008年第11期1132-1137,共6页

目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况。方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆... 目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况。方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆菌E.coliDH5α,克隆PCR法筛选菌落,测序鉴定后大量抽提质粒。磁性转染法将pHT导入SMMC-7721,加热处理后,用RT-PCR法检测tk基因的整合。结果:获得重组的hsv-tk基因条带。结论:成功构建了pHT质粒,可用于进行靶向性基因治疗研究。 展开更多

关键词 真核表达 pHsp70-hsv-tk 构建 热诱导表达 重组真核表达质粒

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甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定 被引量：1

4

作者 段媛媛 杨成丽 +4 位作者 周建刚 范文韬 彭建新 江月 刘德立 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期345-347,352,共4页

利用DNA重组技术 ,将杆状病毒极早期基因ie1启动子基因克隆至重组质粒pGEM Se39中 ,成功地构建了重组真核表达质粒pGEM IE1 Se39.

关键词 甜菜夜蛾 核型多角体病毒 vp39 基因重组 真核表达质粒 iel启动子 核衣壳蛋白基因 基因克隆 pGEM-IE1-Se39

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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建 被引量：2

5

作者 朱建中 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期453-454,共2页

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中... 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 人疱疹病毒8型 K12基因 重组真核表达载体 构建

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重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究 被引量：8

6

作者 黄波 冯作化 +1 位作者 张桂梅 李东 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第3期168-172,共5页

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 1... 目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。 展开更多

关键词 pCH510质粒 基因转染 化疗 肿瘤 小鼠 重组FN多肽真核表达载体

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重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应 被引量：4

7

作者 杨欣伟 隋延仿 +5 位作者 李增山 曲萍 叶菁 武文 董海龙 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期443-446,共4页

目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。... 目的　构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。 展开更多

关键词 重组SEA基因真核表达载体 肝癌 超抗原 肝癌 CTL 免疫效应 动物实验

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鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探 被引量：3

8

作者 程志萍 程安春 +5 位作者 汪铭书 陈斌 刘闯 段坤 周雪 陈孝跃 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1066-1071,共6页

为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接... 为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。 展开更多

关键词 基因枪 鸭IFN—α真核表达质粒 鸭瘟弱毒疫苗 细胞免疫 分子佐剂

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人PIF1及其截短体重组蛋白的真核表达及其细胞内定位 被引量：2

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作者 李珊珊 刘旭 +5 位作者 张莹 王建校 刘晓丹 王豫 周平坤 顾永清 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期595-598,699,共5页

目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B... 目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光法检测其细胞内定位。结果成功构建了PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于核内,PIF1C定位于整个细胞,呈弥散分布,PIF1N主要定位于核内。结论在真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1N对PIF1的入核起重要作用,为进一步研究其PIF1及其各结构域奠定了实验基础。 展开更多

关键词 解螺旋酶 PIF1 重组质粒 蛋白表达 免疫荧光 真核表达

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带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响 被引量：3

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作者 纪宗玲 陈苏民 +5 位作者 刘断中 吴元明 张俊杰 路凡 朱帮福 李毅 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期1445-1448,U002,共5页

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGF... 目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。 展开更多

关键词 基因表达 细胞形态 细胞周期 人era真核表达载体 绿色荧光蛋白 ERA基因

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人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染 被引量：2

11

作者 陈陵 李志宏 +5 位作者 杨仕明 李晶晶 蔡永国 房殿春 罗元辉 王东旭 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期47-49,共3页

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2... 目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。 展开更多

关键词 肝素酶 荧光真核表达载体 转染

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带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建 被引量：3

12

作者 范文韬 刘德立 +1 位作者 孙晓洁 杨成丽 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第2期213-215,共3页

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.

关键词 绿色荧光蛋白基因 植物重组表达质粒 pBI-GFP

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抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

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作者 何颖 黄力 +3 位作者 章亚男 黎怀星 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期55-57,共3页

目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,... 目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,然后以克隆出的小鼠 Ig G重链区 c DNA为模板 ,用 PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和 Ig G重链区基因融合在一起的序列 ,并插入到 p VAX质粒载体中。结果 :扩增出来的 4种不同组合的抗原表位基因和 Ig G重链区基因融合序列大小分别为 999、1 0 2 0、1 0 0 5、1 0 2 6 bp,均与 Gen Bank上登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序亦显示抗原表位基因和 Ig G重链区基因为所需基因 ,接头序列也完全正确。结论 :成功构建了抗阿尔茨海默病的 4种表位基因 - Ig G重链区融合表达的重组质粒 。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 重组真核表达载体 抗原 基因序列 基因表达

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野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建

14

作者 巴茂文 刘振国 +3 位作者 倪培华 陈生弟 李琳 陆国强 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第5期455-458,共4页

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结... 目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结果酶切和DNA测序证实,野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中,野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致,C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒。 展开更多

关键词 UCHL1 突变型 基因真核表达 质粒构建 RT-PCR方法 真核表达质粒 L1基因 DNA测序 人野生型 羧基末端 胚脑组织 定点突变 基因序列 水解酶 SOE 基因分 插入 酶切

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碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

15

作者 许予明 马兴荣 +4 位作者 宋波 秦洁 唐洲平 赵国强 张苏明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期578-581,共4页

目的 :构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的真核表达载体 ,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法 :①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型 ,取缺血灶... 目的 :构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的真核表达载体 ,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法 :①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型 ,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增bFGF基因 ;②将bFGFDNA克隆到pGEM TEasy质粒 ,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定 ;③然后将bFGFDNA亚克隆到pEGFP N3质粒 ;通过抗性基因筛选阳性克隆 ,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果 :菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论 :经RT 展开更多

关键词 碱性成纤维细胞生长因子 逆转录聚合酶链反应 荧光真核表达载体

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鸭α-干扰素真核表达质粒的构建及其对DVH弱毒苗免疫鸭细胞免疫调节作用研究

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作者 刘闯 程安春 +6 位作者 汪铭书 陈斌 程志萍 段坤 杨梅 周雪 陈孝跃 《四川农业大学学报》 CSCD 2007年第1期94-98,112,共6页

为检测鸭α-干扰素对鸭细胞免疫的调节作用，本文按常规方法构建了鸭α-干扰素真核表达质粒（pcDNA-DuIFN-α），并以50、100、200μg分别肌注28日龄樱桃谷鸭，15d后免疫鸭病毒性肝炎（DVH）弱毒疫苗，设空载体＋DVH弱毒疫苗、生理盐水... 为检测鸭α-干扰素对鸭细胞免疫的调节作用，本文按常规方法构建了鸭α-干扰素真核表达质粒（pcDNA-DuIFN-α），并以50、100、200μg分别肌注28日龄樱桃谷鸭，15d后免疫鸭病毒性肝炎（DVH）弱毒疫苗，设空载体＋DVH弱毒疫苗、生理盐水、DVH弱毒疫苗以及pcDNA—DuIFN-α对照组，采用流式细胞仪（FACS）和淋巴细胞增殖试验（MTT法）分别对免疫鸭外周血的CD3^＋淋巴细胞总数和T淋巴细胞转化能力进行动态检测。结果：①CD3^＋淋巴细胞数量：7～56d实验组极显著（P≤0．01）高于生理盐水和显著高于（P≤0．05）DVH弱毒苗、空载体＋DVH弱毒疫苗和pcDNA-DuIFN—α对照组，14～28d 100μg组显著（P≤0．05）高于50和200μg组；②T淋巴细胞对ConA的反应能力（OD值）：21～56d实验组极显著（P≤0．01）高于生理盐水和显著高于（P≤0．05）DVH弱毒苗、空载体＋DVH弱毒疫苗和pcDNA-DuIFN—α对照组，50和100μg组差异不显著，28～56d均略高于200μg组。研究表明pcDNA—DuIFN—α是一种优秀的鸭细胞免疫的分子增强剂和DVH弱毒疫苗的分子佐剂，肌注100μg／只的效果最佳。 展开更多

关键词 鸭α-干扰素真核表达质粒 细胞免疫调节 鸭病毒性肝炎病毒弱毒疫苗

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βhCG-CTP/pcDNA3重组真核表达载体的构建及表达

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作者 张力 吴玉章 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期24-27,共4页

目的　克隆并表达 βhCG CTP基因片端 ,探讨采用 βhCG CTP基因片段免疫小鼠进行免疫避孕的可能性。 方法　采用化学合成法得到含有 βhCG CTP基因片段 ,亚克隆至真核表达载体pcDNA3中 ,然后转化大肠杆菌DH5α ,利用脂质体介导将pcDNA3 ... 目的　克隆并表达 βhCG CTP基因片端 ,探讨采用 βhCG CTP基因片段免疫小鼠进行免疫避孕的可能性。 方法　采用化学合成法得到含有 βhCG CTP基因片段 ,亚克隆至真核表达载体pcDNA3中 ,然后转化大肠杆菌DH5α ,利用脂质体介导将pcDNA3 /βhCG CTP重组质粒表达载体转染到COS 7细胞 ,免疫组化法检测 βhCG CTP基因在哺乳动物细胞中的表达情况。结果　重组质粒经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切和测序证实插入序列与预期设计完全一致 ;利用脂质体介导将pcDNA3 /βhCG CTP重组质粒表达载体导入COS 7细胞 ,获得了 βhCG CTP的瞬时表达。 结论　成功构建了 βhCG CTP真核表达载体pcDNA3 /βhCG CTP ,该载体能在哺乳动物细胞中正确表达 ,表达产物 βhCG CTP能够被抗 βhCG抗体所识别。 展开更多

关键词 人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端37肽 重组真核表达质粒

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鸡柔嫩艾美耳球虫HP基因的真核表达及其对鸡巨噬细胞凋亡的影响 被引量：1

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作者 许中衎 王黎霞 +5 位作者 张榕珍 张一弛 芳卉 潘晨帆 张建军 安健 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第6期34-38,42,共6页

HP基因编码蛋白是本实验室近期发现的一种鸡柔嫩艾美耳球虫的外分泌蛋白。本试验旨在构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至细胞内,以此来分析HP基因对宿主细胞凋亡的影响。以柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子cDNA为模板进行PCR扩增,... HP基因编码蛋白是本实验室近期发现的一种鸡柔嫩艾美耳球虫的外分泌蛋白。本试验旨在构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至细胞内,以此来分析HP基因对宿主细胞凋亡的影响。以柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子cDNA为模板进行PCR扩增,然后克隆至荧光真核表达质粒pEGFP,构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至鸡巨噬细胞(HD11),42 h后采用流式细胞术检测宿主细胞凋亡情况。菌液PCR鉴定和测序鉴定结果显示,重组荧光真核表达载体pEGFP-HP构建成功。流式细胞术检测发现,pEGFP-HP重组质粒组的早期凋亡率显著高于pEGFP空质粒组和空白对照组(P<0.01)。结果表明柔嫩艾美耳球虫HP基因会促进HD11的细胞凋亡,尤其是早期细胞凋亡。本试验为进一步研究HP基因的生物学功能及其作用机制提供了依据,且将HP基因从此命名为柔嫩艾美耳球虫凋亡诱导基因(IA)。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 HP基因 重组荧光真核表达质粒 细胞凋亡

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猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立 被引量：8

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作者 温立斌 何孔旺 +4 位作者 杨汉春 郭容利 李成仁 卢维彩 贾付从 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第B08期5-8,共4页

依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系... 依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程。结果表明,该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点,为猪体内IL-2、IL-12I、FN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA水平的定量检测,提供了必要的技术手段。 展开更多

关键词 TH1/TH2型细胞因子 外周血单个核细胞 重组质粒 实时荧光定量PCR

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人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建 被引量：2

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作者 杨爱玲 徐琛蓉 +3 位作者 章锦才 钟良军 殷春一 赵川江 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期133-135,共3页

目的　构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法　采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组... 目的　构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法　采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果　①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论　用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。 展开更多

关键词 人釉原蛋白 重组质粒 编码区基因真核表达载体 基因治疗

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