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DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定 被引量：4
1
作者 陈敏 项红兵 田玉科 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期75-79,共5页
目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸... 目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。 展开更多
关键词 DREAM基因 RNA干扰 重组腺相关病毒载体
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NOS反义RNA重组腺相关病毒载体体内提高脑细胞耐缺血能力的实验研究 被引量：2
2
作者 杨卫忠 陈春美 +4 位作者 王春华 石松生 陈建屏 黄勇 蔡冬生 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期291-295,共5页
目的探讨二种分别携带神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV—AsnNOS和rAAV-AsiNOS）提高脑细胞耐受缺血能力的作用机制。方法应用立体定位技术将预处理好的病毒载体转染至将要梗... 目的探讨二种分别携带神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV—AsnNOS和rAAV-AsiNOS）提高脑细胞耐受缺血能力的作用机制。方法应用立体定位技术将预处理好的病毒载体转染至将要梗死侧的基底节区，转染病毒滴度为2×10^9mL～，并将SD大鼠分为4组：即rAAV-AsnNOS组，rAAV-AsiNOS组，rAAV—LacZ组和对照组；处理后运用MACO建立缺血模型，每组分为缺血早期和缺血晚期，流式细胞术（FCM）检测NT阳性细胞百分比和细胞凋亡率，逆转录反应系统（RT-PCR）分析nNOS、iNOS，p38MAPK，Caspase-3 mRNA的表达。结果一定剂量的重组病毒载体转染到大鼠海马区域，无神经损伤症状；转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血早期（缺血1～6h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV—AsiNOS组降低；转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞在缺血晚期（缺血24—72h），NT阳性细胞百分比、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV-AsnNOS组降低，差异有统计学意义。结论转染重组病毒载体后动物模型脑神经细胞能够耐受缺血损伤，转染rAAV-AsnNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血早期抑制nNOS、p38MAPK和Caspase-3的表达，转染rAAV—AsiNOS病毒载体的脑神经细胞能够在缺血晚期抑制iNOS、038MAPK和Caspase-3的表达，从而在缺血后抑制神经细胞凋亡的发生。 展开更多
关键词 脑缺血 一氧化氮合酶 凋亡 重组腺相关病毒载体
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重组腺相关病毒载体在脑缺血动物模型基因治疗中的应用 被引量：2
3
作者 李照建 王任直 《中国脑血管病杂志》 CAS 2007年第10期477-480,共4页
关键词 重组腺相关病毒载体 基因治疗 动物模型 脑缺血 病毒载体系统 中枢神经系统 国内外研究 RAAV
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重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用(英文) 被引量：1
4
作者 张梅珍 袁洪 +1 位作者 黄志军 胡帆 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期178-184,共7页
腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点。rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛。在过去几... 腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点。rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛。在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒载体 心血管疾病 基因治疗
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重组腺相关病毒载体的免疫性研究及其解决策略 被引量：1
5
作者 卢超 万江波 +2 位作者 唐明清 肖卫东 许瑞安 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2010年第5期577-583,共7页
重组腺相关病毒载体(rAAV)作为一种高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗的临床前和临床研究中具有极广泛的应用前景。目前在全球范围内已有71项临床研究在进行之中或已经完成。其中有相当部分在血友病、视网膜疾病、帕金森、囊... 重组腺相关病毒载体(rAAV)作为一种高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗的临床前和临床研究中具有极广泛的应用前景。目前在全球范围内已有71项临床研究在进行之中或已经完成。其中有相当部分在血友病、视网膜疾病、帕金森、囊性纤维化以及癌症等疾病的治疗中都取得了显著疗效。随着临床上的成功,人们对rAAV所引起的免疫性及其应对策略也进行了更为广泛而深入的研究。本文将就rAAV的外壳蛋白以及目的基因产物所引起的免疫性进行综合探讨,并结合我们的部分研究工作从改变外壳蛋白、给药方式以及消除内源性外壳蛋白的表达等方面对消除外壳蛋白所引起的免疫性的一些策略加以详述。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒载体 免疫性 基因产物 外壳蛋白 内源性
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提高重组型腺相关病毒转导效率的研究现状 被引量：3
6
作者 殷子斐 王丽娜 +1 位作者 王园 凌晨 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期49-59,共11页
重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AAV)载体是目前基因治疗研究中常用的、非常有前景的载体之一。欧洲第一个批准上市的基因治疗药物正是基于r AAV。然而,r AAV的转导效率相对有限,导致其治疗成本过高;且过高剂量... 重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AAV)载体是目前基因治疗研究中常用的、非常有前景的载体之一。欧洲第一个批准上市的基因治疗药物正是基于r AAV。然而,r AAV的转导效率相对有限,导致其治疗成本过高;且过高剂量的r AAV可以激发人体的免疫反应,降低其疗效。因此,如何提高r AAV的转导效率一直是基因治疗领域研究的热点之一。目前常用的提高r AAV转导效率的方法有:使用组织特异性强的血清型/变体、应用蛋白酶体抑制剂、突变衣壳蛋白表面裸露氨基酸、增加单链DNA的第二链合成、构建自身互补型双链载体等。就这些方法各自的原理、应用现状及优劣势进行系统地综述。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒载体 基因治疗 转导效率
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Complexin-1/2过表达重组载体对阿尔茨海默病小鼠记忆损伤的实验研究
7
作者 张艳玲 刘建军 +1 位作者 许华 杨细飞 《中国临床解剖学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第2期191-197,共7页
目的构建Complexin-1/2(CPLX-1/2)基因的重组腺相关病毒过表达载体p AAV-CPLX-1/2并研究其在阿尔茨海默病记忆损伤中的作用。方法将用Oligo 7软件对Genbank上小鼠CPLX-1/2m RNA的CDS两端序列进行分析,合成CPLX-1/2基因,构建过表达载体... 目的构建Complexin-1/2(CPLX-1/2)基因的重组腺相关病毒过表达载体p AAV-CPLX-1/2并研究其在阿尔茨海默病记忆损伤中的作用。方法将用Oligo 7软件对Genbank上小鼠CPLX-1/2m RNA的CDS两端序列进行分析,合成CPLX-1/2基因,构建过表达载体并转化至大肠杆菌Top10;选取正确的克隆进行PCR和测序鉴定。重组腺相关病毒载体测序正确后,转染AAV293细胞,包装腺相关病毒。将重组腺相关病毒经脑立体定位注射到三转基因阿尔茨海默病(3XTg-AD)小鼠海马CA3区,经免疫组化和Western-Blot检测CPLX-1/2蛋白表达情况,水迷宫检测CPLX-1/2过表达对3XTg-AD小鼠记忆的影响。结果 PCR及测序结果表明成功构建了含小鼠CPLX-1/2基因的重组腺相关病毒表达载体。CPLX-1/2在海马CA3表达显著增加。CPLX-1/2过表达显著改善3XTg-AD小鼠的记忆损伤。结论本研究成功构建了CPLX-1/2重组腺相关病毒过表达载体并在整体动物水平成功高效表达;CPLX-1/2过表达可显著改善3XTg-AD小鼠空间记忆的损伤。为在整体动物水平深入研究CPLX-1/2的功能提供了新的手段;研究结果提示CPLX-1/2可能作为AD记忆损伤治疗的关键靶点。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 Complexin-1/2 重组腺相关病毒载体 基因过表达
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人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达及生物活性分析
8
作者 杜芝燕 王芳 +4 位作者 朱静潆 于继云 王宇 朱晓明 张巍 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期225-228,共4页
目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,... 目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,收集转染上清,以Western blot法检测目的蛋白的表达,应用L929细胞测定重组表达产物对人和大鼠TNF-α细胞毒中和活性,采用ELISA比较重组表达产物对人和大鼠TNF-α的结合活性。结果成功构建重组表达载体pAAV/hTNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白hTNFR-Fc的表达,重组表达产物可有效结合人TNF-α并中和其L929细胞毒活性,并对大鼠TNF-α具有一定程度的结合和中和活性。结论成功构建了hTNFR-Fc融合基因,验证了其在AAV载体上的分泌性表达,并对其生物活性进行了鉴定,为进一步病毒包装和大鼠关节炎动物实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 hTNFR—Fc 重组腺相关病毒载体 表达 活性
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rAAV-AsiNOS抑制C6胶质瘤细胞生长的实验研究
9
作者 石松生 陈春美 +3 位作者 杨卫忠 王春华 王锐 金昌丹 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期631-634,共4页
目的探讨携带诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)反义RNA重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体(rAAV-AsiNOS)对胶质瘤细胞生长增殖的影响以及对iNOS和血管内皮生长因子(vascular endoth... 目的探讨携带诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)反义RNA重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体(rAAV-AsiNOS)对胶质瘤细胞生长增殖的影响以及对iNOS和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达的影响。方法根据C6细胞培养基成分不同分为3组,即空白组[含10%胎牛血清的改良Eagle培养基(DMEM)培养液,n=4]、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene z,lacz)重组腺相关病毒载体(rAAV-LacZ)组(含有rAAV-LacZ的10%胎牛血清的DMEM培养液,n=4)和rAAV-AsiNOS组(含有rAAV-AsiNOS的10%胎牛血清的DMEM培养液,n=4),C6细胞生长曲线;3组同时进行培养1、3、6、12、24 h,应用流式细胞仪(FCM)检测C6细胞中NT阳性细胞百分比、iNOS和VEGF阳性细胞百分比,应用半定量反转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)分析iNOS和VEGF mRNA表达。结果一定感染复数的重组病毒载体rAAV-LacZ对C6胶质瘤细胞生长趋势无明显影响,而rAAV-AsiNOS重组病毒载体在转染C6细胞从3d开始出现细胞生长缓慢,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,NT、iNOS和VEGF阳性细胞在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义(P>0.05),而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现NT、iNOS和VEGF阳性细胞百分比下降,NT百分比分别为9.37%±1.2%,97.3%±0.75%和4.62%±0.53%;iNOS百分比分别为18.42%±2.17%,14.29%±1.44%和8.31%±1.30%;VEGF百分比分别为7.85%±0.98%,6.32%±0.78%和5.04%±0.41%,较空白组之间差异均有统计学意义(P<0.05);半定量RT-PCR分析结果显示,同一时间中,iNOS mRNA在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义(P>0.05),而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现iNOS mRNA表达下降,分别为0.46±0.04,0.34±0.03和0.21±0.03,较同一时间空白组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体rAAV-iNOS能够抑制C6胶质瘤细胞生长增殖,能够抑制iNOS表达,从而通过抑制VEGF基因表达发挥抗胶质瘤细胞生长增殖的重要作用。 展开更多
关键词 胶质瘤iNOS 重组腺相关病毒载体 VEGF 细胞增殖
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侧脑室注射rAAV-HIF-1α基因治疗AD模型大鼠的研究 被引量：4
10
作者 孙祎敏 郝宏强 +2 位作者 孔卫娜 刘凌云 柴锡庆 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期2711-2714,共4页
目的在体观察侧脑室注射缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)腺相关病毒rAAV-HIF-1α对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响。方法健康雄性SD大鼠32只随机分为4组,每组8只:①... 目的在体观察侧脑室注射缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)腺相关病毒rAAV-HIF-1α对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响。方法健康雄性SD大鼠32只随机分为4组,每组8只:①正常组(normal组):未作任何特殊处理;②AD模型组(AD组):右侧脑室注射2μlβ-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)25-35(10mg/m1);③假手术组(sham组):右侧脑室注射2μl生理盐水;④AD模型+rAAV-HIF-1a组(AD+rAAV-HIF-1a组):右侧脑室注射2μl Aβ25-35后1周右侧脑室注射10μl rAAV-HIF-1a(1×1012v.g/.m1)。以上各组动物于注射Aβ25-35或生理盐水后5周取材检测海马神经细胞HIF-1a蛋白表达及凋亡百分率。结果 Western blot检测表明rAAV-HIF-1α组海马神经细胞HIF-1α蛋白表达明显增强(P<0.05),同时可显著降低Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡百分率。结论侧脑室注射rAAV-HIF-1α能够在AD模型大鼠海马高效表达HIF-1α蛋白并抑制海马神经细胞凋亡。 展开更多
关键词 基因治疗 阿尔茨海默病 重组人类缺氧诱导因子-1α腺相关病毒载体 海马
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