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重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验与TST在学校结核潜伏感染筛查中的比较 被引量：23
1
作者 苏倩 汪清雅 +1 位作者 张婷 刘英 《中国感染控制杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期547-551,共5页
目的 比较重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验(EC)与结核菌素皮肤试验(TST)两种检测方法的筛查效能及成本效益,探讨更适合学校结核潜伏感染的筛查方法。方法 选取2021年9月重庆市某中学高一新生共计283名,采用整群随机抽样方法分为EC组(... 目的 比较重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验(EC)与结核菌素皮肤试验(TST)两种检测方法的筛查效能及成本效益,探讨更适合学校结核潜伏感染的筛查方法。方法 选取2021年9月重庆市某中学高一新生共计283名,采用整群随机抽样方法分为EC组(138名)和TST组(145名),分别于左前臂皮内注射0.1 mL EC或0.1 mL TST,观察注射72 h后皮肤反应。皮肤试验前采集283名学生的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测,以IGRA检测结果为标准,分别计算EC、TST试验结果的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率,并分析三者的成本效益。结果 EC的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为54.55%、93.70%、45.45%、90.58%;TST的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为61.11%、81.10%、38.89%、78.62%。每检出1例结核分枝杆菌感染者,TST、EC、IGRA的检测成本分别为124.29、492.86、4 879.31元。结论 EC与IGRA检测结果一致性较好,较TST的特异度和一致率更高,检测成本效益较高,简便易行,有望成为学校结核分枝杆菌潜伏感染新的筛查方法。 展开更多
关键词 重组结核分枝杆菌融合蛋白 结核感染 肺结核 结核菌素纯蛋白衍生物 Γ-干扰素释放试验 结核菌素皮肤试验
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重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析 被引量：6
2
作者 徐春华 朱士玉 +7 位作者 胡屹 易可华 宋灿磊 王紫纯 邬勇 王青 杨芊茹 沈鑫 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期897-902,共6页
目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝... 目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 接触者追踪 分枝杆菌感染 重组结核杆菌融合蛋白
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18~65岁人群重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验应用剂量及在3~17岁和66~75岁人群中的安全性:一项随机、盲法、阳性对照Ⅱ期临床试验
3
作者 王敬 王庆枫 +5 位作者 荆玮 王宇津 王雪钰 黄海荣 初乃惠 聂文娟 《中国防痨杂志》 北大核心 2025年第7期840-845,共6页
背景:结核菌素皮肤试验使用结核菌素纯蛋白衍生物,广泛用于结核病筛查,但结核菌素皮肤试验无法明确区分结核分枝杆菌潜伏感染、卡介苗免疫和活动性结核病。因此,需要开发更准确的结核病诊断方法。重组结核杆菌融合蛋白由结核分枝杆菌标... 背景:结核菌素皮肤试验使用结核菌素纯蛋白衍生物,广泛用于结核病筛查,但结核菌素皮肤试验无法明确区分结核分枝杆菌潜伏感染、卡介苗免疫和活动性结核病。因此,需要开发更准确的结核病诊断方法。重组结核杆菌融合蛋白由结核分枝杆菌标准株H37Rv的早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)蛋白组成,具有诊断结核分枝杆菌潜伏感染、结核病和卡介苗接种后状态的作用。方法:研究分两个阶段进行,第一阶段采用随机、盲法、同类制品对照的同体双臂皮试设计,比较不同剂量组重组结核杆菌融合蛋白、对照试剂在18~65岁结核病患者中的敏感度及健康受试者、非结核性肺部疾病患者中的特异度;计算不同剂量组重组结核杆菌融合蛋白的受试者工作特征曲线(ROC曲线)及曲线下面积(AUC),评价试验药物的最佳诊断试验分界值;分别评价重组结核杆菌融合蛋白、对照试剂及γ干扰素释放试验3种检测试剂的一致率,同时评价重组结核杆菌融合蛋白的安全性。第二阶段采用开放性、单臂研究设计,受试者单臂给药,评价重组结核杆菌融合蛋白在3~17岁和66~75岁人群中应用的安全性。讨论:本研究旨在对重组结核杆菌融合蛋白用于结核分枝杆菌潜伏感染和结核病诊断的评估和用药安全性评价,期望通过临床研究,将基于重组结核杆菌融合蛋白的结核病诊断技术手段推广到更广泛的人群和临床应用中。 展开更多
关键词 结核 重组融合蛋白质类 临床试验
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究 被引量：7
4
作者 王平 王丽梅 +5 位作者 张薇 柏银兰 康健 郝彦斐 罗泰来 徐志凯 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第3期145-149,共5页
目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、... 目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。 展开更多
关键词 分枝杆菌 耻垢 重组融合蛋白质类 结核菌苗 免疫活性
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重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备 被引量：2
5
作者 李红霞 陈建平 +6 位作者 曾林子 刘刚 姚卫 杨筠 刘杨椅 王涛 田玉 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期131-135,共5页
目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68... 目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的rESAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定。结果重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。结论成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 esat6-ppe68融合基因 rESAT6-PPE68融合蛋白 原核表达
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重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染的有效性和安全性系统评价 被引量：17
6
作者 程晓 陈哲 +13 位作者 焦雪峰 杨楠 刁莎 倪晓凤 刘峥 何思颐 曾力楠 万朝敏 康德英 吴斌 应斌武 张慧 赵荣生 张伶俐 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2022年第9期917-926,共10页
目的:系统评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的有效性和安全性。方法:检索临床指南数据库、生物医学文献数据库、卫生行政部门和行业协会官方... 目的:系统评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的有效性和安全性。方法:检索临床指南数据库、生物医学文献数据库、卫生行政部门和行业协会官方网站及不良反应监测官方网站,检索时间均自建库截止到2022年2月。英文检索词:Recombinant Mycobacterium tuberculosis fusion protein、CFP10/ESAT6;中文检索词:重组结核分枝杆菌融合蛋白、重组结核杆菌融合蛋白、宜卡、CFP10/ESAT6。收集重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)诊断MTB感染有效性和安全性的指南、共识、团体标准、系统评价和原始研究等。由2名研究者独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的偏倚风险,根据异质性大小采用Meta分析或描述性分析。结果:纳入指南2部、专家共识3篇、团体标准2部,均指出重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)可用于诊断MTB感染和结核病辅助诊断。纳入系统评价1篇,结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)皮肤试验共招募参与者887名,其敏感度为86.06%(95%CI:82.39%~89.07%)。纳入原始研究4篇,均为随机对照试验,有效性Meta分析结果显示,不区分人群,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度(89.3%vs.90.4%)和阴性似然比(0.177 vs.0.220)的差异无统计学意义,重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度(85.5%vs.47.3%)、诊断比值比(42.238 vs.8.040)、阳性似然比(6.048 vs.1.710)、阳性预测值(66.0%vs.35.1%)、阴性预测值(96.2%vs.94.0%)优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),差异有统计学意义。安全性结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良事件均为局部瘙痒和疼痛,均未发生严重不良事件。结论:重组结核杆菌融合蛋白(EC)可用于MTB感染诊断、辅助结核病诊断,相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),其有效性表现更优。 展开更多
关键词 重组结核杆菌融合蛋白(EC) 结核菌素试验 皮肤试验 分枝杆菌 结核 Meta分析(主题)
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结核分枝杆菌Rv2647蛋白对肺组织损伤效应的初步研究
7
作者 金霄 陈晓林 +4 位作者 姚静 杜兴冉 颜海豪 李国莉 冯旰珠 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第11期1517-1524,共8页
目的:通过噬菌体重组技术分别构建结核分枝杆菌Rv2647基因的敲除株和回补株以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),评估结核分枝杆菌Rv2647蛋白对模型鼠肺组织的损伤效应。方法:构建同源交换位点并整合到结核分... 目的:通过噬菌体重组技术分别构建结核分枝杆菌Rv2647基因的敲除株和回补株以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),评估结核分枝杆菌Rv2647蛋白对模型鼠肺组织的损伤效应。方法:构建同源交换位点并整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组,获取噬菌粒并将其导入Ms,构建具有同源交换位点的重组噬菌体。体外扩增获得高滴度重组噬菌体并转染结核分枝杆菌(H37Rv),37℃静置培养28 d,挑取单克隆进行PCR验证,获得Rv2647基因敲除株(H37RvΔRv2647)。PCR扩增Rv2647基因并通过无缝克隆分别将其整合到载体pMV361和pMV261多克隆位点处,获得阳性质粒后分别电转化H37RvΔRv2647和Ms,获得结核分枝杆菌回补株(H37RvΔRv2647::Rv2647)及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Ms::Rv2647)。分别以H37Rv、H37RvΔRv2647、H37RvΔRv2647::Rv2647、Ms及Ms::Rv2647的菌液经气管攻击C57BL/6小鼠,分别比较H37Rv(30 d)与Ms(7 d)模型鼠的存活率、肺组织细菌负荷及肺组织病理损伤程度。结果:PCR结果显示,H37RvΔRv2647中Rv2647基因缺失,而H37RvΔRv2647::Rv2647及Ms::Rv2647中Rv2647基因皆存在。H37RvΔRv2647、H37Rv及H37RvΔRv2647::Rv2647组模型鼠30 d存活率分别为100.00%、83.33%及83.33%;Ms和Ms::Rv2647组模型鼠的7 d存活率分别为100.00%和83.33%;H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织细菌负荷(lgCFU)为(3.40±0.18),显著低于H37Rv组(3.86±0.15,P<0.001)和H37RvΔRv2647::Rv2647组(3.80±0.16,P<0.01);H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织炎症面积(%)为(4.37±3.06),显著低于H37Rv组(62.76±14.24,P<0.001)和H37RvΔRv2647::Rv2647组(67.37±0.45,P<0.001);Ms组模型鼠肺组织lgCFU为(2.53±0.16),显著低于Ms::Rv2647组(2.81±0.13,P<0.01);Ms组模型鼠肺组织炎症面积(%)为(5.71±1.29),显著低于Ms::Rv2647组(33.13±13.84,P<0.05)。结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2647基因敲除株(H37RvΔRv2647)及回补株(H37RvΔRv2647::Rv2647)以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌(Ms::Rv2647)。Rv2647蛋白可能通过抑制宿主对结核分枝杆菌的清除,加重了模型鼠肺组织病理损伤。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 差异区域 Rv2647蛋白 噬菌体重组技术 肺组织损伤
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力 被引量：12
8
作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-446,共4页
目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原... 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 疫苗 ESAT6 CFP10 重组融合蛋白
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3种结核分枝杆菌特异性重组蛋白诊断价值的初步研究 被引量：7
9
作者 吕冰 樊学军 +5 位作者 刘忠华 孙敏 刘志广 田绿波 万康林 王吉顺 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期290-292,共3页
目的评价重组38kD、Ag85B和16kD蛋白3种重组蛋白的诊断价值。方法采用蛋白免疫印迹方法观察本实验室克隆表达的结核分枝杆菌38kD、Ag85B和16kD蛋白抗原用于结核病血清学诊断的灵敏度,及3种抗原联合应用诊断的灵敏度。结果共对62例结核... 目的评价重组38kD、Ag85B和16kD蛋白3种重组蛋白的诊断价值。方法采用蛋白免疫印迹方法观察本实验室克隆表达的结核分枝杆菌38kD、Ag85B和16kD蛋白抗原用于结核病血清学诊断的灵敏度,及3种抗原联合应用诊断的灵敏度。结果共对62例结核病人血清和19例健康人血清进行了IgG抗体检测,结果显示重组38kD检测灵敏度为51.6%,假阳性率为5.2%;重组Ag85B灵敏度为35.5%,重组16kD的灵敏度22.6%,无1例健康人血清与重组Ag85B及16kD蛋白反应。3种蛋白联合诊断的灵敏度为77.4%,假阳性率为5.2%。结论多种蛋白抗原联合应用将是结核病血清学诊断试剂的发展方向。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组蛋白抗原 诊断 免疫印迹
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结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值 被引量：11
10
作者 刘忠华 丁元生 +5 位作者 毕爱笑 冯永红 金瑞良 杨华 秦莲花 胡忠义 《中国防痨杂志》 CAS 2009年第10期565-569,共5页
目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),1... 目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),16 kD,38 kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65 kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 血清学试验
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 被引量：9
11
作者 李娟 吴雪琼 +3 位作者 张俊仙 李香兰 张灵霞 梁建琴 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2004年第4期204-208,共5页
目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a... 目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果　重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 CFP10-ESAT6融合蛋白 大肠杆菌 免疫学 基因表达
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定 被引量：6
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作者 都伟欣 陈保文 +2 位作者 沈小兵 苏城 王国治 《中国防痨杂志》 CAS 2006年第4期221-224,共4页
目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达... 目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组CFP10-ESAT6融合蛋白 豚鼠 皮试
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结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白的表达和纯化及其诱导的免疫应答特征 被引量：4
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作者 陈富超 朱权 +3 位作者 余艳艳 万康林 罗奇志 余平 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期925-931,共7页
目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用... 目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用,评价其作为抗结核病候选疫苗的潜力。方法:在细菌的对数生长期加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导细菌表达Rv2654重组蛋白,用亲和层析纯化,蛋白质印迹法鉴定Rv2654重组蛋白。采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应性。以Rv2654重组蛋白免疫昆明小鼠,采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平,并以流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群分布。结果:成功表达Rv2654重组蛋白,以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达(均P<0.05),流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞,这种作用在联合卡介苗应用时更为明显,Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。结论:Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答,而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力,有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Rv2654重组蛋白 细胞免疫 体液免疫 结核疫苗
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结核分枝杆菌rHpsX-MPT64融合蛋白的制备与临床应用 被引量：5
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作者 张艳 范大鹏 +2 位作者 岳永宁 杜蓬 孙爱华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期40-44,共5页
目的构建结核分枝杆菌融合基因hpsX-mpt64原核表达系统,建立基于rHpsX-MPT64为包被抗原酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)并对其用于结核患者血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法PCR扩增并克隆结核分... 目的构建结核分枝杆菌融合基因hpsX-mpt64原核表达系统,建立基于rHpsX-MPT64为包被抗原酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)并对其用于结核患者血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法PCR扩增并克隆结核分枝杆菌hpsX和mpt64基因,以连接引物PCR构建hpsX-mpt64人工融合基因,建立上述目的基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白,Western Blot检测其免疫性。分别以rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原,建立相应ELISA检测150例健康人群、73例非结核肺部疾病患者和277例活动性肺结核患者血清标本中抗体。结果克隆的hpsX和mpt64及构建的hpsX-mpt64融合基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达量分别为细菌总蛋白的20.3%、28.5%和26.5%,其提纯物电泳后均显示单一条带。基于rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA对涂阳患者血清抗体检出率明显高于涂阴患者(P<0.01),检测活动性结核患者血清抗体的敏感性分别为59.2%、61.4%和74.4%,特异性分别为90.6%、83.9%和91.0%,rHpsX-MPT64为包被抗原敏感性明显高于rHpsX和rMPT64抗原(P<0.01)。结论基于rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA有较高的敏感性和特异性,重组融合蛋白为抗原有助于进一步提高检测结核病血清学诊断的敏感性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 hpsX-mpt64融合基因 重组表达 酶联免疫吸附试验
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重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应研究 被引量：12
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作者 蒲江 陶立峰 +1 位作者 邓海清 王德海 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第10期676-680,共5页
目的研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应。方法以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、... 目的研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应。方法以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌与卡介菌等16株菌株的活菌菌液分别经腹股沟皮下攻击豚鼠,每组5只,3～4周后,分别皮内注射TB-PPD、PPD-B和重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白各0.1ml,于注射后24、48h观察局部硬结的纵径与横径,根据48h的反应结果进行判定。结果PPD-B对16种分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;TB-PPD对结核、牛、非洲分枝杆菌和卡介菌等活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对结核、牛和非洲分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5;而对鸟、胞内、蟾蜍、堪萨斯、海、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、草、微黄和卡介菌等分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应均呈阴性,阳性比例均为0/5。结论重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白能提高结核分枝杆菌感染诊断的特异度并能区别结核分枝杆菌是否存活、卡介菌致敏导致的皮试超敏反应。 展开更多
关键词 分枝杆菌属 皮肤试验 重组融合蛋白质类 细菌蛋白质类
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结核分枝杆菌重组MPT64蛋白对豚鼠淋巴细胞增殖反应的影响 被引量：4
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作者 张灵霞 吴雪琼 +3 位作者 李洪敏 梁建琴 张俊仙 史迎昌 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2004年第4期248-249,共2页
关键词 结核分枝杆菌 重组MPT64蛋白 豚鼠 淋巴细胞 细胞增殖 影响因素 迟发型超敏反应
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结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定 被引量：2
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作者 赵勇 张海 +5 位作者 赵善民 伍静 毛峰峰 郭晓雅 张彩勤 师长宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期961-965,共5页
目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基... 目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。 展开更多
关键词 HBHA hIL-12 耻垢分枝杆菌 重组疫苗 融合蛋白
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结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究 被引量：4
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作者 阳幼荣 吴雪琼 +5 位作者 张俊仙 梁艳 张翠英 董梅 陈红兵 何菊芳 《中国防痨杂志》 CAS 2010年第7期391-394,共4页
目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核... 目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体。结果 rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗Mtb81抗体的阳性率分别为1.1%和6.2%。结论 rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。 展开更多
关键词 血清学试验 分枝杆菌 结核 重组蛋白质类 细菌蛋白质类 抗原 细菌
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重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性 被引量：2
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作者 孙文霞 谭云洪 +3 位作者 袁仕善 谭笑 夏燕 陈婧 《中国防痨杂志》 CAS 2010年第6期306-309,共4页
目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆... 目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。结论重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 细菌蛋白质类
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响 被引量：5
20
作者 赵勇 师长宏 +4 位作者 张彩勤 毛峰峰 白冰 伍静 张海 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第6期13-16,共4页
目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western b... 目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT6-CFP10融合蛋白 自噬 自噬相关基因(atg)
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