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副结核分支杆菌MAP0862-2191c串联蛋白的原核表达及反应原性检测
1
作者 郝彦儒 郭号 +3 位作者 谢梦圆 陈坚 杨文洁 徐晓静 《动物医学进展》 北大核心 2025年第4期28-34,共7页
副结核分支杆菌(MAP)由于其胞内寄生的特性,难以在早期发现,待发现后往往已经不再具备治疗价值,因此寻找并制备出能同时在早晚期都有显著标识作用的抗原蛋白,有利于更好地诊断牛副结核病。通过生物信息学软件对MAP的MAP0862和MAP2191c... 副结核分支杆菌(MAP)由于其胞内寄生的特性,难以在早期发现,待发现后往往已经不再具备治疗价值,因此寻找并制备出能同时在早晚期都有显著标识作用的抗原蛋白,有利于更好地诊断牛副结核病。通过生物信息学软件对MAP的MAP0862和MAP2191c两种蛋白进行一级、二级及三级结构上的理化性质、抗原性分析及相对位置建模预测,判断串联蛋白重组表达的可行性;使用柔性肽短链序列(G4S)2连接两段序列构建了重组表达载体pET30a-MAP6291c,将其导入至BL21(DE3)原核表达载体中进行诱导表达,并进行Western blot分析。结果显示,预测MAP0862-2191c串联蛋白为一个有多个抗原表位的亲水性的蛋白,两种蛋白在三级结构上无相互影响,因此可以进行原核表达;构建合成的融合基因双酶切结果与预期结果相符;经SDS-PCGE凝胶电泳检测成功表达串联蛋白,大小约68.5 ku,与预期蛋白大小相符;分别选择鼠源抗His抗体及MAP阳性牛血清作为一抗进行Western blot验证,均显示MAP0862-2191c重组蛋白有单一的特异性条带,位置及大小与预期结果一致,证明了该串联蛋白制备的正确性,并且具有良好的反应原性,能够作为牛副结核病的诊断蛋白,为后续建立牛副结核病的诊断方法奠定了良好基础。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 MAP0862 MAP2191c 蛋白预测 串联表达
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重组结核分支杆菌38000蛋白质抗原免疫学特性的研究 被引量：3
2
作者 张小刚 何秀云 +2 位作者 熊志红 李书琳 张永胜 《实用医学杂志》 CAS 2002年第1期19-20,共2页
目的 :探讨国产结核分支杆菌蛋白 380 0 0 (rTPA38)的免疫学特性 ,用以寻找特异性的诊断试剂和筛选新一代疫苗。方法 :( 1)皮肤实验法。H37RV致敏豚鼠 ,5IU国际标准品PPD为阳性对照 ,0 .2 μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射 ,2 4,48,... 目的 :探讨国产结核分支杆菌蛋白 380 0 0 (rTPA38)的免疫学特性 ,用以寻找特异性的诊断试剂和筛选新一代疫苗。方法 :( 1)皮肤实验法。H37RV致敏豚鼠 ,5IU国际标准品PPD为阳性对照 ,0 .2 μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射 ,2 4,48,72h后测量红肿硬结反应横纵径。 ( 2 )ELISA检测 9种羊抗分支杆菌血清并检测结核病人血清中特异性抗结核抗体。结果 :0 .2 μgrTPA38蛋白质抗原在 2 4,48,72h结果基本相似 ,与国家标准品相比均可诱发豚鼠迟发性超敏反应 (DTH) ,其效力与PPD相似。rTPA38只与羊抗牛、BCG、耻垢分支杆菌有交叉反应。用rT PA38和PPD为抗原 ,检测肺结核疾病组灵敏度分别为 6 7.2 % ,72 .5 % ;健康献血员组、非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组 ,rTPA38特异性分别为 96 8% ,96 .7% ,87 5 % ;PPD特异性分别为 93.7% ,85 .7% ,6 8.7%。统计结果表明 ,rT PA38蛋白与PPD检测非结核呼吸疾病组、卡介苗阳转组特异性均有显著意义 (P <0 .0 5 )。结论 :rTPA38具有较高的特异性和敏感性 ,并能诱发豚鼠DTH反应 ,有望成为一种新的特异性诊断试剂。 展开更多
关键词 重组结核分支杆菌38000蛋白质 抗原 免疫学特性 研究 迟发性超敏反应 结核疫苗
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几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究 被引量：8
3
作者 张灵霞 吴雪琼 +2 位作者 史迎昌 梁建琴 张俊仙 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2002年第3期116-118,共3页
目的　了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT6 4 (M )、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法　常规皮肤实验法 :灭活H3 7Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5UPPD标准品为阳性对照 ,0... 目的　了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6 (E)、MPT6 4 (M )、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏 (DTH)反应的能力。方法　常规皮肤实验法 :灭活H3 7Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5UPPD标准品为阳性对照 ,0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm ) ,取二者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5UPPD及 0 .8μgE、0 .8μgM、0 .8μgA、0 .4 μgA + 0 .4 μgM、0 .4 μgA + 0 .4 μgE、0 .4 μgE + 0 .4 μgM ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧 ,每批 6只 ,共 3批。注射后 2 4、4 8、72h分别测量硬结反应横、纵直径 (mm) ,取二者的平均值。结果　常规皮肤试验 0 .8μgM、A、M +E及E +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,而 0 .8μgE抗原及M +A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异(P <0 .0 5 )。时间效应 :重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径 2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后 ,结果与常规皮肤试验结果一致。结论　从试验结果? 展开更多
关键词 结核分支杆菌 重组结核分支杆菌蛋白抗原 迟发超敏反应
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重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析 被引量：6
4
作者 徐春华 朱士玉 +7 位作者 胡屹 易可华 宋灿磊 王紫纯 邬勇 王青 杨芊茹 沈鑫 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期897-902,共6页
目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝... 目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 接触者追踪 分枝杆菌感染 重组结核杆菌融合蛋白
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重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值 被引量：38
5
作者 张小刚 庄玉辉 +5 位作者 何秀云 熊志红 董恩军 李书琳 张永胜 李昕 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2001年第5期281-283,共3页
目的　探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法　以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果　 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵... 目的　探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法　以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果　 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论　rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 重组蛋白38kD 结核病 重组蛋白16kD ELISA 血清学诊断
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副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用 被引量：3
6
作者 刘倩 唐泰山 +3 位作者 廉慧锋 王凯民 张常印 雷治海 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期113-117,共5页
从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接EL... 从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接ELISA方法。结果显示:重组蛋白具有良好的抗原性,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(100倍)和抗原包被浓度(4.4μg.mL-1),该方法具有较好的特异性和敏感性。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 Hed蛋白 抗原性分析 间接ELISA
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结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白的表达和纯化及其诱导的免疫应答特征 被引量：4
7
作者 陈富超 朱权 +3 位作者 余艳艳 万康林 罗奇志 余平 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期925-931,共7页
目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用... 目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用,评价其作为抗结核病候选疫苗的潜力。方法:在细菌的对数生长期加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导细菌表达Rv2654重组蛋白,用亲和层析纯化,蛋白质印迹法鉴定Rv2654重组蛋白。采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应性。以Rv2654重组蛋白免疫昆明小鼠,采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平,并以流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群分布。结果:成功表达Rv2654重组蛋白,以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达(均P<0.05),流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞,这种作用在联合卡介苗应用时更为明显,Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。结论:Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答,而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力,有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Rv2654重组蛋白 细胞免疫 体液免疫 结核疫苗
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结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究 被引量：4
8
作者 阳幼荣 吴雪琼 +5 位作者 张俊仙 梁艳 张翠英 董梅 陈红兵 何菊芳 《中国防痨杂志》 CAS 2010年第7期391-394,共4页
目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核... 目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体。结果 rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗Mtb81抗体的阳性率分别为1.1%和6.2%。结论 rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。 展开更多
关键词 血清学试验 分枝杆菌 结核 重组蛋白质类 细菌蛋白质类 抗原 细菌
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结核分枝杆菌重组MPT64蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究 被引量：3
9
作者 张灵霞 吴雪琼 +2 位作者 史迎昌 梁建勤 张俊仙 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第8期414-415,共2页
关键词 结核分枝杆菌 MPT64蛋白抗原 迟发性超敏反应
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基于特异性配体蛋白SMAD2检测法用于 活动性结核病的诊断价值研究
10
作者 谢忠尧 张慕丽 +2 位作者 曹廷明 曹洋 孙照刚 《中国防痨杂志》 北大核心 2025年第6期694-700,共7页
目的:分析基于SMAD2配体蛋白捕捉多种结核抗原的检测方法(简称“SMAD2方法”)对活动性结核病的诊断价值。方法:选取2023年1—3月就诊于首都医科大学附属北京胸科医院的活动性结核病患者152例,进行结核分枝杆菌痰涂片、痰培养、荧光PCR... 目的:分析基于SMAD2配体蛋白捕捉多种结核抗原的检测方法(简称“SMAD2方法”)对活动性结核病的诊断价值。方法:选取2023年1—3月就诊于首都医科大学附属北京胸科医院的活动性结核病患者152例,进行结核分枝杆菌痰涂片、痰培养、荧光PCR检测等结核病相关检查,并选取同时期进行健康体检者177名作为研究对象。基于SMAD2配体蛋白捕捉多种结核抗原的特性,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测活动性结核病患者及健康对照人群血清中的结核抗原含量(用A 450值表示),采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析其诊断结核病的价值。结果:结核病组和健康对照组的结核抗原含量分别为0.589(0.426,0.807)和0.257(0.209,0.340),两者差异有统计学意义(Z=13.050,P<0.001)。ROC曲线分析结果显示,SMAD2方法区分结核病患者与健康对照人群的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.917(95%CI:0.889~0.946);最大约登指数下的诊断敏感度为90.13%(95%CI:84.36%~93.93%),特异度为78.53%(95%CI:71.91%~83.94%)。SMAD2方法诊断结核病的阳性预测值为78.29%(137/175)、阴性预测值为90.26%(139/154),准确率为83.89%(276/329),误诊率为21.47%(38/177),漏诊率为9.87%(15/152)。菌阳患者、菌阴患者的阳性检出率分别为90.37%(122/135)、88.24%(15/17),两者差异无统计学意义(χ^(2)=0.077,P=0.781),PCR阳性患者、PCR阴性患者的阳性检出率分别为88.18%(97/110)、95.24%(40/42),两者差异无统计学意义(χ^(2)=1.702,P=0.192)。结论:SMAD2方法对于活动性结核病尤其是菌阴结核病的诊断具有潜在的辅助诊断价值。 展开更多
关键词 Smad2蛋白质 分枝杆菌 结核 抗原 诊断
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结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：5
11
作者 王丽梅 姜泓 +1 位作者 康健 靳芊芊 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期191-195,共5页
目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,... 目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体。PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2。将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2。RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定。结果Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因。IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白。结论成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 多阶段抗原 AG85B ESAT-6 Rv2031c Rv2626c 重组腺病毒
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3种结核分枝杆菌特异性重组蛋白诊断价值的初步研究 被引量：7
12
作者 吕冰 樊学军 +5 位作者 刘忠华 孙敏 刘志广 田绿波 万康林 王吉顺 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期290-292,共3页
目的评价重组38kD、Ag85B和16kD蛋白3种重组蛋白的诊断价值。方法采用蛋白免疫印迹方法观察本实验室克隆表达的结核分枝杆菌38kD、Ag85B和16kD蛋白抗原用于结核病血清学诊断的灵敏度,及3种抗原联合应用诊断的灵敏度。结果共对62例结核... 目的评价重组38kD、Ag85B和16kD蛋白3种重组蛋白的诊断价值。方法采用蛋白免疫印迹方法观察本实验室克隆表达的结核分枝杆菌38kD、Ag85B和16kD蛋白抗原用于结核病血清学诊断的灵敏度,及3种抗原联合应用诊断的灵敏度。结果共对62例结核病人血清和19例健康人血清进行了IgG抗体检测,结果显示重组38kD检测灵敏度为51.6%,假阳性率为5.2%;重组Ag85B灵敏度为35.5%,重组16kD的灵敏度22.6%,无1例健康人血清与重组Ag85B及16kD蛋白反应。3种蛋白联合诊断的灵敏度为77.4%,假阳性率为5.2%。结论多种蛋白抗原联合应用将是结核病血清学诊断试剂的发展方向。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组蛋白抗原 诊断 免疫印迹
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结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定 被引量：8
13
作者 蒋玉凤 钟森 +3 位作者 史小玲 王明勇 张建军 邓存良 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期65-68,47,共5页
目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物... 目的　用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法　以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果　用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论　结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 ESAT-6 真核表达质粒 蛋白表达 鉴定 早期分泌性抗原靶蛋白
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结核分支杆菌HSP65蛋白在真核细胞中的瞬时表达 被引量：5
14
作者 居巍 刘君炎 +1 位作者 佘应龙 曹飞 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期216-217,共2页
关键词 抗结核病 HSP65 结核分支杆菌 真核细胞 瞬时表达 蛋白 HIV 多重耐药菌株 疫苗 防治工作
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5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性分析 被引量：3
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作者 杨柳 苏明权 +4 位作者 岳乔红 张建芳 马越云 刘家云 郝晓柯 《中国防痨杂志》 CAS 2009年第7期381-383,共3页
目的评价14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性。方法利用14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种重组蛋白建立ELISA方法,检测120份结核病人、30份非结核呼吸道感染病人和30份健康人血清中相应抗体。结果ELISA显... 目的评价14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性。方法利用14、16、38kD、mtb81和ESAT-6等5种重组蛋白建立ELISA方法,检测120份结核病人、30份非结核呼吸道感染病人和30份健康人血清中相应抗体。结果ELISA显示5种结核杆菌特异性蛋白质的特异性均高于95%;敏感性和准确性则不尽相同,其中38kD的检测敏感性最高,为80.8%;14、16kD、mtb81和ESAT-6的检测敏感性分别为52.5%、68.3%、35.8%和44.2%。结论5种结核杆菌特异性蛋白质均具有不同程度的抗原性。进一步提高抗原或抗体的检测灵敏度将有利于结核病的诊断。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组蛋白质类 抗原 细菌 细菌蛋白质类
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究 被引量：7
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作者 王平 王丽梅 +5 位作者 张薇 柏银兰 康健 郝彦斐 罗泰来 徐志凯 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第3期145-149,共5页
目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、... 目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。 展开更多
关键词 分枝杆菌 耻垢 重组融合蛋白质类 结核菌苗 免疫活性
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结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测 被引量：2
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作者 丁淑琴 徐文锦 +1 位作者 杨园园 杨风琴 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期306-310,共5页
目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体，成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后用... 目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体，成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni^2＋的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2，并用Westernblot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明，成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phos2／pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示，上清液中只见极少量的特异蛋白表达带，沉淀部分可见明显的特异表达带，说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37953．1ku，理论等电点为5．75，具有1个跨膜区，位于1-19位，结构域位于1-370位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2／pET32a重组质粒，phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 phoS2 重组质粒 表达 纯化 生物信息学 预测
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结核分枝杆菌重组MPT64蛋白对豚鼠淋巴细胞增殖反应的影响 被引量：4
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作者 张灵霞 吴雪琼 +3 位作者 李洪敏 梁建琴 张俊仙 史迎昌 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2004年第4期248-249,共2页
关键词 结核分枝杆菌 重组MPT64蛋白 豚鼠 淋巴细胞 细胞增殖 影响因素 迟发型超敏反应
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冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)原液效力评价用国家参考品的初步建立 被引量：4
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作者 都伟欣 韦芬 +4 位作者 卢锦标 赵爱华 蒲江 王国治 徐苗 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第8期826-831,共6页
目的以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液为... 目的以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液为原材料,研制EC变态反应原原液效力评价用国家参考品。方法以电泳法、高效液相色谱法分别测定备选EC原液纯度,纯度合格后经精密称量、分装、冻干制成候选国家参考品,再测定其蛋白质和水分含量。将候选国家参考品稀释成不同稀释度后,皮内注射结核分枝杆菌活菌致敏的豚鼠,根据皮肤试验硬结或红晕反应平均直径大小(简称"反应平均直径大小")结果探索原液效价测定的适宜稀释度。在此基础上,将候选国家参考品用于EC原液的效价测定并进行方法验证,初步评价其适用性能。研究还初步观察了候选品在-20℃放置24个月的稳定性。结果 EC原液电泳法纯度为100.00%,高效液相色谱法纯度为95.33%,候选国家参考品蛋白质含量为508μg/瓶,水分含量为1.57%,分装精度控制在±1%以内。稀释度探索结果显示:候选品稀释度为2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)和10μg/ml(50U/ml)时剂量对数反应平均直径大小曲线有良好的线性关系(R^2=0.9944),可作为后续研究的适宜稀释度。将候选国家参考品用于EC原液效价测定,两者剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9878,R^2=0.9643),且每个稀释度EC原液与相应稀释度候选国家参考品反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2。方法验证结果显示:候选国家参考品和EC原液的剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9999,R^2=0.9815),且两者相应稀释度反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2,方法可行。初步稳定性研究结果显示:-20℃放置24个月的候选国家参考品效价测定性能稳定。结论候选国家参考品的纯度、蛋白质含量、水分含量及均匀性检测均符合国家参考品质量要求,将其稀释到适宜稀释度后可用于EC原液的效价测定;经方法验证与稳定性观察,显示其性能良好,为国家参考品申报提供了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 冷冻干燥法 参考标准 国家参考品 效价
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重组结核杆菌融合蛋白(EC)的稳定性与有效性研究 被引量：7
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作者 杨蕾 韦芬 +6 位作者 张凯 仇晶晶 汪莹莹 都伟欣 卢锦标 陶立峰 蒲江 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第8期799-806,共8页
目的考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液的储... 目的考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液的储存稳定性、成品储存及使用的稳定性与有效性。方法(1)原液储存稳定性研究:将3批次EC原液储存于-70℃,观察0~36个月,保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行致敏效应试验、鉴别试验、效价检测,以及等电点、分子量、蛋白质含量、纯度(电泳法)等检测,其中致敏效应试验用豚鼠分为试验组(注射EC原液)与对照组(注射稳定剂),观察注射后动物反应,两组动物反应应无差异;鉴别试验为卡介苗致敏后豚鼠分别皮内注射EC原液和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,EC原液皮肤试验应呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD皮肤试验应呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm);效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后6只豚鼠分别皮内注射3个稀释度的EC原液及参考品,观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验局部反应的硬结或红晕平均直径总和的比值(以下简称"平均直径总和比值")应为1.0±0.2;等电点应为3.5~5.3,分子量应为(23±2.0)kDa(1kDa的相对分子质量为1000),蛋白质含量应不低于450.0μg/ml,纯度(电泳法)应不低于95.0%。(2)EC成品储存稳定性研究:成品分别储存于37℃和2~8℃,分别观察0~28d和0~36个月,37℃保存0、7、14、21、28d时、2~8℃保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、苯酚含量等检测,其中鉴别试验方法及检测结果判定如"EC原液"。效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后4只豚鼠分别皮内注射EC成品及参考品,观察测量方法及平均直径总和比值判定如"EC原液",pH值应为6.8~7.4,苯酚含量应不高于3.0g/L。(3)EC成品使用稳定性研究:成品开启后分别放置于温度(25±2)℃、湿度(60±5)%和温度(40±2)℃、湿度(75±5)%两种条件考察使用过程的稳定性,观察时间为0~50min,分别于0、10、20、30、40、50min取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、渗透压摩尔浓度等检测,试验方法和检测结果判定如"EC成品",其中渗透压摩尔浓度应为(280.0±68.0)mOsmol/kg。依据定期取样检测结果是否符合EC质量标准来判断产品稳定性,并为制定EC原液、成品有效期和成品使用时的有效时间提供依据。结果(1)EC原液-70℃观察0~36个月,在各研究时间点,致敏效应试验均表现为试验组与对照组动物反应无差异;鉴别试验结果为EC原液皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果为不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9~1.1;等电点为3.7~5.2;分子量为(23.2~24.2)kDa;蛋白质含量为(501.6~616.7)μg/ml,纯度(电泳法)均为100.0%。(2)EC成品稳定性研究:在各研究时间点,鉴别试验结果为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9~1.0;pH值为7.1~7.4、苯酚含量为(2.6~2.9)g/L。(3)EC成品使用稳定性研究结果:在各研究时间点,鉴别试验结果均为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值均为1.0;pH值为7.1~7.2;渗透压摩尔浓度为(302.4~307.4)mOsmol/kg。结论EC原液-70℃储存36个月质量稳定;成品37℃储存28d、2~8℃储存36个月质量稳定;成品在开启后50min内使用,质量稳定。 展开更多
关键词 重组结核杆菌融合蛋白(EC) 药物稳定性 有效性研究 药物评价
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