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重组病毒载体研究进展 被引量：5
1
作者 王培园 李结 +2 位作者 朱兴全 杨桂连 袁子国 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期284-288,共5页
重组病毒载体是当今病毒基因工程研究的热点之一。载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。近年来,重组病毒载体为由病毒介导的基因表达提供了更为安全可靠的载体渠道,研制能高效转移基因、
关键词 重组病毒载体 病毒基因工程 细胞内表达 目的基因 安全可靠 基因表达 病毒介导 转移基因
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不同重组病毒载体在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染效率及基因表达 被引量：3
2
作者 潘虹 刘新建 +6 位作者 吴继红 田毓华 谢匡成 陈霞芳 张圣海 黄倩 林志新 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第4期306-311,共6页
目的:探讨不同的重组病毒载体对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的转染效率和外源基因表达水平,为利用骨髓间充质干细胞进行细胞和基因治疗提供实验依据。方法:采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心及体外培养方法分离rMSCs,流式... 目的:探讨不同的重组病毒载体对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的转染效率和外源基因表达水平,为利用骨髓间充质干细胞进行细胞和基因治疗提供实验依据。方法:采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心及体外培养方法分离rMSCs,流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD45和CD90的表达鉴定细胞类型。进一步用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组Ad5-EGFP、Ad5F35-EGFP、rAAV1/2-EGFP、rAAV2-EGFP及Lentivirus-EGFP转染体外培养的rMSCs,荧光显微镜观察、流式细胞仪检测EGFP阳性率和荧光强度。结果:rMSCs细胞表面CD11b、CD45和CD90阳性率分别为(14.1±3.3)%、(1.1±0.4)%和(82.3±5.7)%。Ad5-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后流式细胞仪检测,EGFP阳性率分别为(33.6±2.7)%、(88.6±1.0)%及(99.9±0.1)%,荧光强度为4.4±0.3、39.8±1.5及811.4±3.9;Ad5F35-EGFP按10、100和1000MOI转染rMSCs,2d后阳性率分别为(96.9±0.4)%、(99.9±0.1)%及(99.7±0.1)%,荧光平均强度为369.3±14.8、895.4±7.5及703.2±38.4;rAAV1/2-EGFP及rAAV2-EGFP按1×104和1×105vg/细胞转染rMSCs,6d后阳性率分别为(0.94±0.31)%及(1.30±0.36)%,和(2.16±0.38)%及(3.90±0.33)%;LV-EGFP按30(TU/细胞)转染rMSCs,6d后阳性率为(60.5±3.2)%,荧光强度为27.0±3.6。结论:Ad5、Ad5F35及LV能够有效转染体外培养的rMSCs并表达外源基因,转染效率与病毒的用量间存在量效关系。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 基因治疗 重组病毒载体 转染效率 基因表达
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重组病毒载体疫苗在兽医学上的应用
3
作者 NaoakiYOKOYAMA 曹军平 《湖北畜牧兽医》 2000年第4期39-43,共5页
自从痘苗病毒作为疫苗首次应用于预防天花以来,人们研制了许多疫苗以预防多种自然界病源的感染,至今已有200多年的历史。疫苗是最价廉高效的兽药,它包括:减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗。理想的疫苗应能诱导接种动物产生针对某病原... 自从痘苗病毒作为疫苗首次应用于预防天花以来,人们研制了许多疫苗以预防多种自然界病源的感染,至今已有200多年的历史。疫苗是最价廉高效的兽药,它包括:减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗。理想的疫苗应能诱导接种动物产生针对某病原的终生免疫。疫苗不仅用于控制动物出现症状, 展开更多
关键词 重组病毒载体疫苗 疱疹病毒 痘病毒 腺病毒 兽医
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表达猪圆环病毒2d型Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒的构建
4
作者 焦显芹 马晓 +3 位作者 田润博 刘颖 马世杰 陈红英 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期2278-2286,共9页
【目的】利用同源重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得表达猪圆环病毒2d型(PCV2d)Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒(PRV),为开发预防和控制PCV2d和PRV感染的疫苗提供技术支持。【方法】基于PCV2d KF1株ORF 2基因序列设计1对特异引物,以P... 【目的】利用同源重组技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得表达猪圆环病毒2d型(PCV2d)Cap蛋白的重组猪伪狂犬病病毒(PRV),为开发预防和控制PCV2d和PRV感染的疫苗提供技术支持。【方法】基于PCV2d KF1株ORF 2基因序列设计1对特异引物,以PCV2d KF1株DNA为模板扩增ORF 2基因。经限制性内切酶Bam HⅠ酶切后将ORF 2基因引入到含有绿色荧光蛋白(EGFP)基因的PRV转移载体pG中,获得重组质粒pG-PCV2d-EGFP。运用转染试剂ZLip2000将质粒pG-PCV2d-EGFP和PRV三基因缺失毒株gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)PRV NY DNA共转染至ST单层细胞中拯救重组病毒,并利用CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除重组病毒中EGFP基因。经EGFP基因测序、PCR和Western blotting对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经8轮绿色荧光蚀斑筛选,纯化得到重组病毒rPRV-PCV2d-EGFP。CRISPR/Cas9 EGFP基因双敲除质粒敲除EGFP基因后,经3轮筛选没有绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rPRV-PCV2d。EGFP基因测序结果表明,rPRV-PCV2d中EGFP基因被剪截了1251 bp,PCR和Western blotting结果显示,rPRV-PCV2d携带的ORF 2基因能在ST细胞中转录与表达。【结论】本研究成功构建表达PCV2d Cap蛋白的重组病毒rPRV-PCV2d,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病病毒 重组病毒活载体疫苗
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重组新城疫病毒载体疫苗研究进展
5
作者 王芳 楚富茗 +6 位作者 王秋霞 卢浪 蔡畅 张新 李文霞 裴大伟 刘兴友 《动物医学进展》 北大核心 2022年第8期78-83,共6页
新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群... 新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群中没有预先存在的NDV抗体,NDV对人类来说相对安全。因此,NDV作为一种疫苗载体颇受关注。论文简要论述了NDV的生物学特征,外源基因的插入方式,重点阐述了重组新城疫病毒载体疫苗的研究进展,以期为设计其他有效的兽用和人用活载体疫苗提供参考。 展开更多
关键词 新城疫病毒 新城疫病毒载体 重组病毒载体 疫苗
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pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究 被引量：8
6
作者 赵婧 徐广贤 +4 位作者 贾伟 董辉 张一琳 赵志军 魏军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期153-155,159,共4页
目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨... 目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。 展开更多
关键词 pri-miR-21 重组腺病毒载体 TLR4基因 靶向调控
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人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 被引量：6
7
作者 许波群 李瑛 +5 位作者 薛凯 李梅 马翔 刁飞扬 崔毓桂 刘嘉茵 《医学研究生学报》 CAS 2010年第2期117-122,共6页
目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程，多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表达人SET基因的... 目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程，多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后，与退火的寡核苷酸连接，构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接，构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein，GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后，转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率，用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功；重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达；获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测，SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比，SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05），抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET，并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用，为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。 展开更多
关键词 SET基因 RNA干扰 重组腺病毒载体
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牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达 被引量：3
8
作者 房红莹 鲁俊鹏 +4 位作者 曾小娜 王雷 陈钜豪 刘健 罗满林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期159-164,共6页
目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延... 目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 ESAT-6 CFP-10 重组腺病毒载体
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人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定 被引量：4
9
作者 李志全 朱庆生 +4 位作者 朱锦宇 郝伟 许彦鸣 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期344-347,共4页
目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 ... 目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 。 展开更多
关键词 神经营养素3 脑源性神经营养因子 四环素 重组腺病毒载体
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大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：3
10
作者 张赟 龚敏 +4 位作者 毕杨 江伟 喻琴 李廷玉 陈洁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期144-147,共4页
目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与... 目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。 展开更多
关键词 TOLL样受体2 SIRNA 重组腺病毒载体 免疫调节
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新型Smad7重组腺病毒载体的构建 被引量：6
11
作者 陈颖伟 胡良凯 +1 位作者 陈源文 李定国 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第6期417-420,共4页
目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-Smad7,线性化后与... 目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况。结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 重组腺病毒载体 AdSmad7 信号转导 TGF-Β 分子生物学
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胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定 被引量：5
12
作者 马春明 杨朝鲜 +3 位作者 闫乃红 袁琼兰 高小青 邓莉 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期199-202,共4页
构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、... 构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。 展开更多
关键词 胶质细胞源性神经营养因子 重组腺病毒穿梭载体 基因重组 大鼠
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CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达 被引量：5
13
作者 郭小荑 邓宇斌 +1 位作者 陆才生 李树浓 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期585-589,T002,共6页
目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基... 目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。 展开更多
关键词 CTLA4Ig重组腺病毒载体 构建 体外表达 T淋巴细胞 细胞塞件 免疫球蛋白 基因治疗 移植排斥
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靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体构建及其在NIH3T3细胞中的表达 被引量：3
14
作者 李祥勇 罗海清 +1 位作者 林观平 周克元 《医学研究生学报》 CAS 2010年第12期1240-1243,共4页
目的慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究。文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础。方法... 目的慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究。文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础。方法根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1 cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达。结论成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据。 展开更多
关键词 Bi-1 重组慢病毒载体 NIH3T3
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小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 被引量：3
15
作者 薛凯 李梅 +3 位作者 刁飞扬 凌静 崔毓桂 刘嘉茵 《医学研究生学报》 CAS 2009年第2期115-119,I0001,共6页
目的:构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体。方法:根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。... 目的:构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体。方法:根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。PmeⅠ酶切pShuttle-H1-siRNA,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒pAdEasy-H1-siRNA后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。Westernblot检测NR4A1基因的表达。结果:穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功,进一步构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体,重组腺病毒AdH1-siRNA/NR4A1感染小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)后显著抑制目的蛋白表达(抑制率为70%～90%)。结论:成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA/NR4A1,并在MLTC-1中验证其抑制NR4A1蛋白表达,为进一步研究NR4A1基因在多囊卵巢综合征(PCOS)中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 RNA干扰 重组腺病毒载体 核受体NR4A1 多囊卵巢综合征
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番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定 被引量：2
16
作者 林锋强 程晓霞 +4 位作者 王劭 朱小丽 王锦祥 陈仕龙 陈少莺 《福建农业学报》 CAS 北大核心 2016年第10期1015-1019,共5页
应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为... 应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。 展开更多
关键词 番鸭呼肠孤病毒 σC基因 重组腺病毒载体
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DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定 被引量：4
17
作者 陈敏 项红兵 田玉科 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期75-79,共5页
目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸... 目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。 展开更多
关键词 DREAM基因 RNA干扰 重组腺相关病毒载体
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大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建 被引量：2
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作者 李方成 李军亮 +4 位作者 梁伟强 刘然义 吴中华 张培峰 袁开长 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期2284-2286,共3页
目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因(GLUT1)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA,将其克隆至穿梭质粒pShuttle中... 目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因(GLUT1)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA,将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-G lut1,经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α,构建重组腺病毒质粒pAd-G lut1,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后,分别用聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(W estern b lotting)从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确;筛选出重组腺病毒质粒pAd-G lut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒,包装后冻融细胞行PCR及W estern b lotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体,这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。 展开更多
关键词 葡萄糖转运体1 基因扩增 重组腺病毒载体
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“两步转化法”高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体 被引量：3
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作者 杨文宇 黄宗海 +2 位作者 汤福祥 钱勇 车小燕 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第2期164-167,共4页
目的采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌,制备AdEasy-1细菌;自载体pBS-CD中切出CD基因,亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上,构建的pAdtrackCMV-CD线性化后... 目的采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌,制备AdEasy-1细菌;自载体pBS-CD中切出CD基因,亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上,构建的pAdtrackCMV-CD线性化后转化AdEasy-1细菌,抽提同源重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,在293细胞中包装与扩增,利用GFP报告基因进行滴度测定。同时按“一步转化法”进行同样的重组腺病毒制备,比较二者的优劣性。结果“两步转化法”终产物17个克隆中13个正确,正确率为76.5%(13/17);“一步转化法”重组产物17个克隆中有2个正确,正确率为11.8%(2/17),两者具有显著性差异(P=0.000 17)。结论“两步转化法”细菌内同源重组是一种更高效、更方便的重组腺病毒制备方法。 展开更多
关键词 两步转化法 制备 自杀基因 重组腺病毒载体 恶性肿瘤 基因治疗
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小鼠端粒酶蛋白亚单位重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：2
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作者 姜楠 陆敏强 +5 位作者 李华 蔡常洁 杨扬 许赤 冯炼强 陈规划 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期11-14,共4页
目的构建小鼠端粒酶蛋白亚单位(mousetelomerasereversetranscriptase,mTERT)基因重组腺病毒载体,为下一步研究其体外表达和动物实验研究提供基础。方法从肝癌细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增mTERT的基因编码区序列,将序列定向克隆... 目的构建小鼠端粒酶蛋白亚单位(mousetelomerasereversetranscriptase,mTERT)基因重组腺病毒载体,为下一步研究其体外表达和动物实验研究提供基础。方法从肝癌细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增mTERT的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pAC,将此表达质粒与腺病毒重组质粒pJM17共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒载体Ad-mTERT,纯化后的重组腺病毒载体Ad-mTERT在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测定病毒滴度。结果PCR及酶切证实:mTERTDNA正确克隆到穿梭质粒pAC中,带mTERTDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区,并在293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒Ad-mTERT。结论成功构建了小鼠TERT基因重组腺病毒载体,为研究其用于肿瘤的基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 小鼠端粒酶蛋白亚单位 重组腺病毒载体
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