毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较 被引量：4

1

作者 李健 彭远义 《生物技术通报》 CAS CSCD 2006年第3期58-62,共5页

将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓... 将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和MutS重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。 展开更多

关键词 植酸酶 MutS重组子 Mut^+重组子 酶学性质

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毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

2

作者 李健 何锡杲 彭远义 《饲料工业》 2005年第24期17-21,共5页

将重庆市草食家畜与牧草重点实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛... 将重庆市草食家畜与牧草重点实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和Muts重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。 展开更多

关键词 植酸酶 Mut^s重组子 Mut^+重组子 酶学性质

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人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建 被引量：2

3

作者 李薇 黄玉 +5 位作者 杨波 迟小华 刘丽宏 张峰 严江伟 卢学春 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期421-426,共6页

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上... 本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。 展开更多

关键词 ID4基因 启动子 荧光素酶报道重组子 聚合酶链式反应

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微生物融合重组子的鉴定——DNA分子检测技术 被引量：1

4

作者 张修军 《生物学杂志》 CAS CSCD 1999年第2期5-7,共3页

融合子是双亲融合的产物，必然带有双亲的分子标记，因此ＤＮＡ水平上的分子标记是鉴别融合子最可靠的指标。生物群体中等位基因的差异导致遗传多样性，它形成的分子基础是基因组ＤＮＡ序列变异。在生物基因组中，还存在大量不编码ＤＮ... 融合子是双亲融合的产物，必然带有双亲的分子标记，因此ＤＮＡ水平上的分子标记是鉴别融合子最可靠的指标。生物群体中等位基因的差异导致遗传多样性，它形成的分子基础是基因组ＤＮＡ序列变异。在生物基因组中，还存在大量不编码ＤＮＡ序列，它们是中性的，在进化过程中... 展开更多

关键词 微生物 融合重组子 鉴定 DNA分子检测

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一种高通量快速鉴定重组子方法的建立

5

作者 王亚男 黄培华 樊宝良 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第5期65-66,共2页

利用添加了RNaseA的1X cracking buffer直接裂解细菌增强观测效果,排除RNA干扰,通过琼脂糖凝胶电泳与空载体质粒进行比较,建立一种高通量快速鉴定重组子的方法。该方法方便易行,大大提高了工作效率。

关键词 CRACKING BUFFER 直接裂解 RNAseA 重组子鉴定 克隆鉴定 优化方法

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一种利用碱裂解法快速筛选重组子的方法

6

作者 吕新 陈丽华 李玥仁 《福建农业科技》 2016年第5期13-15,共3页

根据碱裂解法提取质粒DNA的原理,利用碱裂解法快速筛选到重组子,该方法快迅、准确,可应用于基因克隆中的重组菌落快迅检测。

关键词 碱裂解法 重组子 快速 筛选

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链霉菌种内融合重组子产生新活性物质的分离和初步鉴别 被引量：1

7

作者 段瑜侃 袁德军 周启 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第6期407-409,共3页

从农抗５１０２产生菌（吸水链霉菌应城亚种）的种内融合中筛选到１株融合重组子ＦＲ－００５，它除了产生亲本所产生的３种抗生素外，尚能产生亲本没有的一种新活性物质。通过正丁醇萃取从发酵滤液中分离到这种对苏云金芽孢杆菌和啤酒... 从农抗５１０２产生菌（吸水链霉菌应城亚种）的种内融合中筛选到１株融合重组子ＦＲ－００５，它除了产生亲本所产生的３种抗生素外，尚能产生亲本没有的一种新活性物质。通过正丁醇萃取从发酵滤液中分离到这种对苏云金芽孢杆菌和啤酒酵母有抑制活性的物质，再经过硅胶柱、氧化铝柱和微晶纤维素柱依次连续分离，进一步又用硅胶Ｇ薄层层析分离，即得到纯度相当高的只对苏云金芽孢杆菌有活性的精制品。精制品经过稳定性、呈色反应、紫外可见光谱、纸层析谱、氨基酸组成等检测。 展开更多

关键词 吸水链霉菌 种内融合 重组子 分离 鉴别

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一种鉴定重组子的快速简便方法

8

作者 何文芳 孙晗笑 谢作煊 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 2001年第4期359-359,共1页

关键词 DNA 重组子 聚合酶链反应 质粒

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表达人源SOD的毕赤酵母重组子的构建 被引量：4

9

作者 李新鸣 孙冶 肖纯凌 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1117-1123,共7页

目的研究在毕赤酵母重组子中高表达有活性人源超氧化物歧化酶(SOD)方法。方法在毕赤酵母构建表达重组人源SOD,对培养时间、培养基中铜离子浓度和甲醇诱导条件进行优化,并初步纯化SOD。结果获得了5个稳定表达人源SOD的毕赤酵母重组子。... 目的研究在毕赤酵母重组子中高表达有活性人源超氧化物歧化酶(SOD)方法。方法在毕赤酵母构建表达重组人源SOD,对培养时间、培养基中铜离子浓度和甲醇诱导条件进行优化,并初步纯化SOD。结果获得了5个稳定表达人源SOD的毕赤酵母重组子。色谱层析方法分离纯化重组子培养上清中的SOD。在培养48 h,培养基中铜离子浓度0.5%、甲醇诱导浓度1%时上清中SOD分泌量多,同时活力最好。结论建立毕赤酵母表达可溶性人源SOD的有效方法,实现了在毕赤酵母系统高效表达有活性人源SOD。为发酵生产人源SOD提供了研究基础。 展开更多

关键词 毕赤酵母 重组子 人源超氧化物歧化酶

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动态重组子网的Petri网飞机虚拟维修过程建模与仿真 被引量：3

10

作者 钱文高 马红岩 耿宏 《计算机应用与软件》 北大核心 2021年第7期93-99,共7页

针对大型民用飞机虚拟维修仿真中部件繁多、维修行为关系复杂、模型庞大等问题,提出可动态重组子网的Petri网飞机虚拟维修过程建模方法。使用UML状态机建立维修实体状态迁移元模型,以规范维修实体的维修行为,并将其转化为Petri网子网模... 针对大型民用飞机虚拟维修仿真中部件繁多、维修行为关系复杂、模型庞大等问题,提出可动态重组子网的Petri网飞机虚拟维修过程建模方法。使用UML状态机建立维修实体状态迁移元模型,以规范维修实体的维修行为,并将其转化为Petri网子网模型;依据部件间的联结关系构建双向邻接矩阵,约束各子网间的维修行为关系,进而建立可动态重组子网的虚拟维修过程模型。通过空客A320飞机交输活门作动筒组件的拆卸仿真实例验证了该模型的有效性。 展开更多

关键词 飞机虚拟维修 UML状态机 PETRI网 动态重组子网 过程模型

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一种快速筛选和鉴定重组体的方法——改良菌落PCR 被引量：5

11

作者 毕美霞 韩玲 杨渝珍 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第1期78-79,共2页

在对DNA片段进行亚克隆的实验中,阳性重组子的筛选是鉴定外源DNA是否插入载体的重要步骤。常用的方法有两种:一是在含抗生素的平皿上挑取转化生长的单菌落,经液体培养基扩大培养后,提取质粒,再经酶切或PCR扩增鉴定;另外,还可以用菌落原... 在对DNA片段进行亚克隆的实验中,阳性重组子的筛选是鉴定外源DNA是否插入载体的重要步骤。常用的方法有两种:一是在含抗生素的平皿上挑取转化生长的单菌落,经液体培养基扩大培养后,提取质粒,再经酶切或PCR扩增鉴定;另外,还可以用菌落原位杂交的方法进行初筛。这两种方法虽然可靠,但是步骤复杂繁琐,而且后一种方法还存在污染问题。我们在构建重组毒素表达载体时,摸索出了一种改良的菌落PCR扩增筛选法,既准确又简易,现介绍如下。 展开更多

关键词 PCR扩增 分子克隆 重组子 筛选 鉴定

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利用聚合酶链反应鉴定重组TPO阳性克隆

12

作者 田生礼 刘丽 李玉新 《东北师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 1997年第1期66-68,共3页

报道了利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）鉴定重组ＴＰＯ阳性克隆的方法，同时比较了该方法与酶切鉴定的结果．取转化克隆小量提取质粒琼脂糖电泳分析，对怀疑含有重组子的工程菌进行ＰＣＲ鉴定，结果阳性克隆得到了特异性扩增片段．该方法... 报道了利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）鉴定重组ＴＰＯ阳性克隆的方法，同时比较了该方法与酶切鉴定的结果．取转化克隆小量提取质粒琼脂糖电泳分析，对怀疑含有重组子的工程菌进行ＰＣＲ鉴定，结果阳性克隆得到了特异性扩增片段．该方法与酶切鉴定结果完全一致，其优点是简便、灵敏。 展开更多

关键词 血小板生成素 重组子 克隆 聚合酶链反应

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含色氨酸启动子载体pMM16的构建

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作者 杜敏杰 马贤凯 《生物学杂志》 CAS 1987年第5期24-26,共3页

在基因工程中,一个好的表达载体(expression vector)必须具有强启动子和插入筛选标志。Edman等构建的ptrpL1载体(图1)虽然含有强启动子一色氨酸(trp)启动子,但没有插入筛选标记。因此,插入重组体的筛选非常困难。细菌必须同时具备半乳... 在基因工程中,一个好的表达载体(expression vector)必须具有强启动子和插入筛选标志。Edman等构建的ptrpL1载体(图1)虽然含有强启动子一色氨酸(trp)启动子,但没有插入筛选标记。因此,插入重组体的筛选非常困难。细菌必须同时具备半乳糖异构酶、半乳糖转移酶和半乳糖激酶才能发酵半乳糖,这三种酶分别由galE galK和galk基因控制。 展开更多

关键词 色氨酸启动子 DNA Mac 浅红色 质粒转化 pMM16 重组子 交换子 外源基因 菌落 转化子 双酶切 重组质粒

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生物防治因子

14

《生物技术通报》 CAS CSCD 1989年第1期79-81,共3页

从苏云金芽孢杆菌(Bacilla thuringiensis)菌株LM2分离到2个隐蔽质粒pHT和pHT103o(分别长8.6和15 kb),接到载体质粒pJH 101并用以转化大HB101和枯草杆菌菌株168氨节青霉素或四环素的Luria-成培养基上筛选出转化子。

关键词 转化子 苏云金芽孢杆菌 物理图谱 芽抱杆菌 转座子 重组子 野生型 棒状病毒 杀虫蛋白 生物杀虫剂

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中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定 被引量：10

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作者 黄海 黄健 +5 位作者 潘秋辉 林天歆 郭正辉 许可慰 江春 韩金利 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期84-87,共4页

【目的】克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子。【方法】从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoRⅠ位点,将P... 【目的】克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子。【方法】从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoRⅠ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定。【结果】首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础。【结论】分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一。 展开更多

关键词 PSMA 前列腺特异性膜抗原 克隆基因 克隆 中国人 DNA 原核表达载体 重组子 原基 RNA

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小麦T型细胞质雄性不育保持系线粒体DNA片段转化不育系的初步研究 被引量：4

16

作者 赵宝存 葛荣朝 +1 位作者 沈银柱 黄占景 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2004年第4期21-23,共3页

细胞质雄性不育在植物界普遍存在,其不育机理一直是人们研究的热点。采用花粉管通道法,利用T型细胞质雄性不育保持系75 3369B线粒体的基因文库,选取其中所载外源片段较大的重组子转化T型不育系小麦75 3369A,结果重组子ME252和ME317的转... 细胞质雄性不育在植物界普遍存在,其不育机理一直是人们研究的热点。采用花粉管通道法,利用T型细胞质雄性不育保持系75 3369B线粒体的基因文库,选取其中所载外源片段较大的重组子转化T型不育系小麦75 3369A,结果重组子ME252和ME317的转化后代变成可育,表明线粒体的部分片段可以使细胞质雄性不育系的育性发生转变。 展开更多

关键词 细胞质雄性不育系 保持系 小麦 不育系 果重 外源 花粉管通道法 重组子 植物界 片段

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双孢蘑菇和姬松茸灭活原生质体融合育种研究 被引量：10

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作者 贺建超 贺聪莹 +2 位作者 卢美欢 马英辉 王玛丽 《中国食用菌》 2014年第1期9-10,共2页

以双孢蘑菇和姬松茸为亲本菌株，通过灭活原生质体融合，经过初筛和复筛，1株新的稳定的双孢蘑菇和姬松茸杂交高产菌株被选育出来。双孢蘑菇原生质体被热灭活（65％，30rain），姬松茸原生质体被紫外线灭活（30w，30cm，10min），双亲... 以双孢蘑菇和姬松茸为亲本菌株，通过灭活原生质体融合，经过初筛和复筛，1株新的稳定的双孢蘑菇和姬松茸杂交高产菌株被选育出来。双孢蘑菇原生质体被热灭活（65％，30rain），姬松茸原生质体被紫外线灭活（30w，30cm，10min），双亲存活率为3．1×10^-7～3．3×10^-8。在聚乙二醇诱导下融合继续生存，亲本原生质体融合被实现，重组频率为4．8×10^-5。 展开更多

关键词 双孢蘑菇 姬松茸 灭活原生质体 融合 重组子

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人α-干扰素2b基因转化番茄、番木瓜的研究(Ⅰ)──—人α-干扰素2b基因植物表达载体构建方法的研究 被引量：4

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作者 周鹏 赵志英 郑学勤 《热带作物学报》 CSCD 1998年第1期52-57,共6页

以PBV889（α－IFN－2b）为基因供体，利用EcoRⅠ／PstⅠ双酶切分离出基因α－IFN－2b，再利用现有的植物表达质粒ROKⅡ（带PRV－CP基因，35Spromoter／NPTⅡ），用XbaⅠ／SacⅠ双酶切分离出大片段（E6）作为基因受体，采用定向连接法... 以PBV889（α－IFN－2b）为基因供体，利用EcoRⅠ／PstⅠ双酶切分离出基因α－IFN－2b，再利用现有的植物表达质粒ROKⅡ（带PRV－CP基因，35Spromoter／NPTⅡ），用XbaⅠ／SacⅠ双酶切分离出大片段（E6）作为基因受体，采用定向连接法将α－IFN－2b拼接在E6上，完成植物表达载体构建。采用DNAdotblot、RNAdotblot对重组子进行筛选验证。 展开更多

关键词 转基因蔬菜 α干扰素2b 表达载体 重组子筛选

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化学与酶促相结合合成并克隆核糖体失活蛋白Gelonin基因 被引量：2

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作者 李卓玉 石亚伟 +2 位作者 袁静明 WiseJ.G TrommerW.E 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2002年第3期394-398,共5页

利用已知 Gelonin的氨基酸序列 ,逆向推算出整个基因的碱基序列 ,根据 E.coli的密码子偏爱性和后续基因克隆的需要 ,通过沉默突变设计相应的酶切位点和碱基序列 ,将整个基因分为四段 ,每个片段约1 75～ 2 2 0 bp,每一个片段中的互补链... 利用已知 Gelonin的氨基酸序列 ,逆向推算出整个基因的碱基序列 ,根据 E.coli的密码子偏爱性和后续基因克隆的需要 ,通过沉默突变设计相应的酶切位点和碱基序列 ,将整个基因分为四段 ,每个片段约1 75～ 2 2 0 bp,每一个片段中的互补链从 5′末端用化学合成 1 0 0～ 1 2 0的碱基单链 ,其中两个链的 3′末端有 2 0个互补碱基 .利用 T4 DNA聚合酶酶促添补成双链 DNA,用分子克隆技术 ,分别构建重组子 ,然后再构建成含整个 Gelonin基因的表达载体 p ET-gel进行表达 ,经诱导后 ,获得了一个 2 80 0 0的重组蛋白 。 展开更多

关键词 核糖体失活蛋白 Gelonin基因 化学合成 重组子 酶促合成 基因克隆

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柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因的克隆和序列分析 被引量：2

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作者 杜爱芳 王素华 索勋 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期592-596,共5页

利用RT PCR方法扩增出了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)ZJ(浙江)株的子孢子表面抗原5401基因。把这一基因片段克隆到PGEM T克隆载体上,得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析,结果表明重组子(pGEM T 5401)中含有5401基因,该序列全长为864bp,序... 利用RT PCR方法扩增出了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)ZJ(浙江)株的子孢子表面抗原5401基因。把这一基因片段克隆到PGEM T克隆载体上,得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析,结果表明重组子(pGEM T 5401)中含有5401基因,该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,有两个碱基发生有义突变,引起两个氨基酸发生突变,核苷酸同源性为99 8%,氨基酸同源性为99 3%。克隆出的5401基因可以用于将来重组疫苗的研究。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 RT—PCR ZJ株 5401基因 克隆 序列分析 E.TENELLA 子孢子 表面抗原 重组子 碱基 氨基酸 突变 核苷酸 同源性 疫苗

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