表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性 被引量：8

1

作者 李文辉 张云 +2 位作者 王树惠 刘力 杨帆 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期650-654,共5页

目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病... 目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66000,与天然GP相对分子质量相符表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物。结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果。 展开更多

关键词 重组腺病毒 狂犬病毒 CVS-N2C 复制缺陷型

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复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究 被引量：4

2

作者 何金生 王健伟 +5 位作者 姜秀丽 王大燕 温乐英 董京芳 屈建国 洪涛 《安徽医科大学学报》 CAS 2002年第2期86-88,共3页

目的　对 1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究。方法　通过灌胃和滴鼻 2种途径对BALB/c小鼠进行免疫 ,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析。结果　初次免疫后 ,2组小鼠均有应答 ,但... 目的　对 1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究。方法　通过灌胃和滴鼻 2种途径对BALB/c小鼠进行免疫 ,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析。结果　初次免疫后 ,2组小鼠均有应答 ,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后 ,显示出明显的加强效果。除了血清IgG外 ,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA ,灌胃组仅在肠道检测到SIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较 ,发现IgG的应答水平明显高于SIgA。免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明 ,抗体可长期持续至少半年以上。 结论　重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果 ,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础。 展开更多

关键词 缺陷型 重组腺病毒 rvAdG1VP7 免疫学 轮状病毒属 遗传学 VP7基因

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人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建 被引量：1

3

作者 陈紫千 汤耀卿 +4 位作者 张奕 张轶 张圣道 刘新垣 邹卫国 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第9期720-722,共3页

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA... 目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。 展开更多

关键词 IL—10 缺陷型 IL-10 重组腺病毒 体外感染 表达 DNA 阳性克隆 质粒 基因重组

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表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

4

作者 徐婷 熊挺 +5 位作者 李淋雨 刘郁夫 温良海 谢文婷 杨泽坤 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第12期1424-1434,共11页

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源... 【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 VP2蛋白 重组复制缺陷型人5型腺病毒

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细菌内快速构建两种用于肝纤维化基因治疗的重组复制缺陷型腺病毒

5

作者 林勇 谢渭芬 +4 位作者 张忠兵 陈伟忠 张新 曾欣 陈岳祥 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期654-657,共4页

目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 ... 目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 u PA c DNA片段与穿梭载体 p Track- CMV连接 ,线性化后与骨架载体 Ad Easy- 1在大肠杆菌 BJ5 183内同源重组获得腺病毒载体 p Ad HGF和 p Adu PA,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒 Ad HGF和 Adu PA;将 Ad HGF和 Adu PA分别体外感染肝细胞株 L0 2 ,以 Northern印迹法和 Western印迹法检测两种病毒在肝细胞中的表达。 结果 :连接、重组后通过酶切和测序法筛选出病毒质粒 p Ad HGF和 p Adu PA;经 2 93细胞包装 ,3d后均观察到绿色荧光蛋白明显表达 ,Cs Cl梯度离心纯化最终分别获得 4× 10 1 0 efu/ m l滴度的重组病毒 Ad HGF和 6× 10 1 0 efu/ ml Adu PA;两种病毒体外感染肝细胞 3d后 ,HGF和u PA表达均明显增加。结论 :细菌内同源重组制备复制缺陷型腺病毒 ,纯化过程简单 ,重组腺病毒在肝细胞中均高效表达 。 展开更多

关键词 肝纤维化 基因治疗 细菌内快速构建 重组复制缺陷型腺病毒 治疗

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重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

6

作者 胡良凯 陈颖伟 李定国 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期120-123,共4页

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10 ,并观察其在肝星状细胞 (HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA ,通过RT PCR获得鼠IL 10cDNA片段 ,插入穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒 (CMV)启动子下游 ,构建重组穿梭载... 目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10 ,并观察其在肝星状细胞 (HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA ,通过RT PCR获得鼠IL 10cDNA片段 ,插入穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒 (CMV)启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV IL 10 ,线性化后与AdEasy 1电穿孔共转化BJ5 183,获得重组腺病毒质粒pAdIL 10。pAdIL 10用Lipo fectamin包装转染HEK 2 93细胞 ,获得重组腺病毒AdIL 10。将AdIL 10体外感染HSC ,3d后抽提HSC总RNA ,以RT PCR检测IL 10的表达。结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL 10 ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)表达 ;AdIL 10感染HSC3d后观察到GFP表达 ,通过RT PCR可检测到IL 10的表达。结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL 10 ;AdIL 10感染HSC后可表达IL 展开更多

关键词 IL-10 表达 HSC 缺陷型 重组腺病毒 观察 293细胞 绿色荧光蛋白(GFP) 总RNA RT—PCR

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表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：14

7

作者 胡永新 赵永刚 +4 位作者 张永强 刘拂晓 樊晓旭 吴晓东 王志亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1635-1641,共7页

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASF... 本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10^9 IFU·m^L^-1;经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 复制缺陷型腺病毒 P72蛋白

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猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定 被引量：2

8

作者 刘文晓 高志强 +4 位作者 蒲静 张伟 刘环 牛建蕊 张鹤晓 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2016年第9期3-6,共4页

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病... 通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎 复制缺陷型腺病毒 疫苗

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表达PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果 被引量：2

9

作者 邓祖丽颖 刘雨丰 +1 位作者 马宁宁 陈陆 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期143-148,共6页

为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,... 为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,分别检测小鼠血清中IgG和唾液、肺部、肠道灌洗液中IgA抗体水平,脾脏T淋巴细胞亚群及相关细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平以及淋巴结、脾脏和肺组织中PCV2病毒载量,评价其黏膜免疫效果。结果显示,与对照组相比,rAd/Cap/518经肌内途径免疫诱导产生的血清IgG抗体水平显著增加;经滴鼻和口服途径免疫诱导产生的局部黏膜部位IgA抗体水平显著增加。rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60%~55.65%,经滴鼻免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为34.43%~37.29%,经肌内和口服途径免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为36.35%~41.58%,经滴鼻途径免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39%~18.32%,经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29%,均显著高于对照组。rAd/Cap/518经滴鼻途径免疫后,能诱导小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞分泌IFN-γ。攻毒后免疫鼠体内病毒载量显著降低。综上,rAd/Cap/518经肌内途径免疫主要诱导全身性免疫应答,经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答,是一种很有前景的黏膜免疫候选疫苗。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 复制缺陷型腺病毒 黏膜免疫 免疫效果

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表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：4

10

作者 陈廷炜 孟宪踊 +3 位作者 王铁成 高玉伟 冯娜 夏咸柱 《野生动物学报》 北大核心 2021年第3期747-754,共8页

为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-T... 为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H,然后与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组,获得重组质粒pAd-CDV-H;重组质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-CDV-H,连续传代后对获得的重组腺病毒分别进行病毒滴定、免疫荧光和Western blot鉴定。经免疫荧光方法及Western blot鉴定结果表明,重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞、Vero细胞后均可以成功表达H蛋白,获得的重组腺病毒的滴度高达1010IFU/mL。成功获得能够表达大熊猫源CDV H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H,在进一步证明其安全有效后,可为大熊猫犬瘟热免疫预防提供候选疫苗株。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 H基因 复制缺陷型重组腺病毒 大熊猫源

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胸腔内注射重组人5型腺病毒治疗晚期肺癌恶性胸腔积液的疗效观察 被引量：15

11

作者 杨帆 卢斌 +5 位作者 胡春燕 李学成 刘志鹏 邹利全 陈陵 朱波 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2013年第17期2885-2886,共2页

目的:观察胸腔内注射重组人5型腺病毒(安柯瑞)治疗肺癌恶性胸腔积液的有效性和安全性。方法:将我院52例肺癌恶性胸腔积液患者随机分为安柯瑞治疗组(26例)和顺铂对照组(26例),胸腔内分别注射安柯瑞或顺铂,观察治疗有效率、不良反应。结果... 目的:观察胸腔内注射重组人5型腺病毒(安柯瑞)治疗肺癌恶性胸腔积液的有效性和安全性。方法:将我院52例肺癌恶性胸腔积液患者随机分为安柯瑞治疗组(26例)和顺铂对照组(26例),胸腔内分别注射安柯瑞或顺铂,观察治疗有效率、不良反应。结果:安柯瑞治疗组和顺铂对照组治疗有效率分别为69.23%及53.84%,两组间比较具有显著差异(P<0.05),两组均出现不同程度的白细胞减少,但较之顺铂对照组,安柯瑞治疗组不良反应明显较轻。结论:安柯瑞胸腔内注射治疗晚期肺癌恶性胸腔积液疗效较好,毒副反应轻。 展开更多

关键词 肺肿瘤 恶性胸腔积液 重组人5型腺病毒 顺铂

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依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平 被引量：4

12

作者 张圣海 吴继红 +6 位作者 刘新建 陈霞芳 田毓华 谢匡成 于慧 潘虹 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第1期14-20,共7页

目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和... 目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和200μg／ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446（人非小细胞肺癌细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）、SMMC-7721（人肝癌细胞株）、SGC7901（人胃癌细胞株）、SKBR-3（人乳腺癌细胞株）和BTT（小鼠膀胱移行上皮癌细胞株）后不同时间，流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度，Western blotting检测EGFP蛋白表达，RT—PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果：不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平，但对EGFP阳性率无明显提高。10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg／ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24h后，细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3．3、3．5、3．1、6．2、7．0、5．4和3．4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍，EGFP mRNA表达量提高，但DNA拷贝数未见明显改变。结论：依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平，该作用可能是在转录水平上发挥作用的。 展开更多

关键词 复制缺陷型腺病毒 依托泊苷 肿瘤 基因表达

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表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究 被引量：4

13

作者 王晓雪 刘延珂 +7 位作者 杨东东 吴艳阳 高冬生 王永生 李永涛 赵军 王川庆 张改平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期127-132,共6页

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp^1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重... 为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp^1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 S基因 复制型重组人腺病毒血清4型 活载体疫苗

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负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 被引量：2

14

作者 陈陵 蔡永国 +4 位作者 郑兴春 杨仕明 房殿春 罗元辉 王东旭 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期38-41,共4页

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行... 目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。 展开更多

关键词 肝素酶 腺病毒科 复制缺陷型腺病毒载体 转染

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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 被引量：2

15

作者 周井祥 薛江东 +3 位作者 刘晔 张守峰 朱霞 扈荣良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期920-923,共4页

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切... 为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白 犬2型腺病毒 重组病毒

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重组5型腺病毒处理不会加重卵清蛋白诱发哮喘小鼠的哮喘症状

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作者 张正玲 张翊玲 +2 位作者 韩婧 路苹 徐琳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1590-1594,共5页

目的探索重组5型腺病毒（rAd5）对卵清蛋白（OVA）诱发的小鼠哮喘模型的影响。方法 60只6~8周龄、体质量18~20 g的雌性C57BL/6小鼠被随机分为健康对照组、rAd5对照组、OVA哮喘对照组、rAd5处理的OVA哮喘组,每组15只。OVA哮喘对照组、rAd... 目的探索重组5型腺病毒（rAd5）对卵清蛋白（OVA）诱发的小鼠哮喘模型的影响。方法 60只6~8周龄、体质量18~20 g的雌性C57BL/6小鼠被随机分为健康对照组、rAd5对照组、OVA哮喘对照组、rAd5处理的OVA哮喘组,每组15只。OVA哮喘对照组、rAd5处理的OVA哮喘组在第0、7、14天分别采用含50μg OVA和2 mg氢氧化铝混悬液腹腔注射致敏3次、于第42、43、44天连续3 d用OVA雾化激发制作哮喘模型。其余两组采用相同体积的生理盐水处理。rAd5对照组、rAd5处理的OVA哮喘组于实验第21天开始肌注rAd5（2.5×109个病毒颗粒/只）1次。并于第35天滴鼻加强1次rAd5（2.5×109个病毒颗粒/只）。所有小鼠于最后一次雾化激发48 h内进行安乐死。通过无创肺功能仪体描法检测小鼠气道高反应,收集血清及肺泡灌洗液标本、收集肺组织用于HE及PAS染色,通过ELISA检测肺泡灌洗液中的白细胞介素4（IL-4）、IL-5、IL-13及血清中的总IgE。结果与健康对照组及rAd5对照组相比,OVA哮喘对照组、rAd5处理的OVA哮喘组其肺部炎症及黏液分泌显著增加,其肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13及血清中的总IgE含量显著增高,其气道高反应显著升高。然而,OVA哮喘对照组与rAd5处理的OVA哮喘组之间无显著差异。结论重组5型腺病毒作用于小鼠哮喘模型不会加重哮喘症状。 展开更多

关键词 小鼠 哮喘 重组5型腺病毒 卵清蛋白

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体内复制缺陷型腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染胶质瘤细胞对5-氟胞嘧啶敏感

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作者 吕彦恩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第2期129-129,共1页

病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细... 病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细胞才易被转染,且TK基因疗法所产生的旁观者效应需依赖细胞间的直接接触。本文介绍通过复制缺陷的腺病毒载体介导将细菌胞嘧啶脱氨酶(cd)基因转染至大鼠9L胶质瘤细胞,使其对在正常细胞没有毒性的核苷-5-氟胞嘧啶(5-Fc)敏感。 展开更多

关键词 体内复制 缺陷型腺病毒载体 胞嘧啶脱氨酶 基因转染 胶质瘤细胞 5-氟胞嘧啶 敏感性 脑肿瘤 基因治疗

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共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

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作者 刘蒙蒙 杨德成 +2 位作者 周国辉 梁特 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期83-86,共4页

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表... 为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 重组人腺病毒5型 绿色荧光蛋白

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猪圆环病毒2型ORF-2全基因重组腺病毒的构建与鉴定

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作者 林祥超 高志强 +4 位作者 张鹤晓 张康 郭金玉 牛建蕊 张乐萃 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2016年第1期24-26,共3页

扩增猪圆环病毒2型的ORF-2全基因(702 bp),将目的片段与缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV K-NpA连接,构建重组穿梭质粒CMV-ORF-2。将穿梭质粒与骨架质粒pacAd5 9.2-100经限制性内切酶PacI线性化后共转染293T细胞,进行细胞内重组。7~15 d... 扩增猪圆环病毒2型的ORF-2全基因(702 bp),将目的片段与缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV K-NpA连接,构建重组穿梭质粒CMV-ORF-2。将穿梭质粒与骨架质粒pacAd5 9.2-100经限制性内切酶PacI线性化后共转染293T细胞,进行细胞内重组。7~15 d后获重组腺病毒rAd5 CMV-OPFF-2与对照组重组腺病毒rAd5 CMV-GFP。使用293细胞进行病毒增殖,对增殖稳定的rAd5 CMV-ORF-2进行鉴定;rAd5 CMV-OPFF-2 TCID_(50),为10^(7.5)/50μL,用该代次rAd5 CMV-ORF-2进行PCV-2阳性血清中和试验,结果表明,重组腺病毒成功,PCV-2阳性血清不能中和重组腺病毒。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 ORF-2 缺陷型重组腺病毒

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复制缺陷型BmNPV载体的构建及初步应用 被引量：4

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作者 费伟强 陈琴 +7 位作者 陈倩 梅文枫 边腾飞 吕正兵 于威 陈健 张耀洲 吴祥甫 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期514-521,共8页

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的... 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的重组病毒构建方法。首先以BmNPV基因组为基础构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,进而利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列,构建了一种复制缺陷型BmNPV穿梭载体RD-BmBacmid。利用RD-BmBac-mid单独转染或者与pBacPAK8-AcGFP共转染BmN细胞,证实了该载体的复制缺陷性,即需经同源重组修复orf1629基因后方可产生重组病毒。利用复制缺陷型BmNPV载体正筛选可以快速构建重组病毒表达目的蛋白质。 展开更多

关键词 家蚕杆状病毒穿梭载体 RED重组 复制缺陷型 转染 正筛选

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