高密度发酵制备重组人可溶性TRAIL 被引量：5

1

作者 王梁华 朱玉平 +4 位作者 娄永华 周劲松 彭玉珍 球谊 焦炳华 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期132-135,共4页

目的 :利用原核重组表达技术 ,完成人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL ,又称凋亡素 2配体 ,Apo- 2 L )的中试。方法 :可溶性 TRAIL编码基因插入改建的 p BV 2 2 0载体 ;在发酵过程中 ,控制溶解氧在 30 %～ 5 0 % ,30℃生长 6... 目的 :利用原核重组表达技术 ,完成人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL ,又称凋亡素 2配体 ,Apo- 2 L )的中试。方法 :可溶性 TRAIL编码基因插入改建的 p BV 2 2 0载体 ;在发酵过程中 ,控制溶解氧在 30 %～ 5 0 % ,30℃生长 6 h,4 2℃诱导培养 4 h;菌体上清行金属亲和层析。结果 :发酵液中最终菌体密度 D(6 0 0 )达 8.0 (相当于每升发酵液含 15 g湿菌体 ) ,TRAIL占菌体总蛋白的 4 0 %左右 ,含量超过 0 .6 g/ L。其中 ,所表达的 TRAIL 2 0 %～ 30 %在上清而直接有活性 ,70 %～ 80 %呈包涵体。上清用亲和层析一步使其纯度达 70 %以上 ;包涵体超声破菌后经两次洗涤 ,纯度达到 80 %以上。　 结论 :TRAIL 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 重组蛋白质 发酵 分批补料 重组人可溶性trail

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重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨 被引量：8

2

作者 李宁丽 路丽明 +4 位作者 沈佰华 刘莉莉 王利 余奇文 张冬青 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2003年第1期10-14,共5页

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理。 方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。 结果100ng/m... 目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理。 方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。 结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26％-57％。不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5％,而诱骗受体DcRl表达55％,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40％-88％),而DcRI表达很低(8％-17％)。rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高。ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性。 结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关。 展开更多

关键词 人可溶性trail蛋白 细胞凋亡 CASPASE-3 诱骗受体 死亡受体

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重组可溶性KDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用 被引量：4

3

作者 刘丽 肖畅 +1 位作者 王烨 曹颖 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2002年第1期23-26,共4页

目的 :分析可溶性KDR(sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。方法 :通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF16 5结合的能力 ;sKDR免疫家兔制备KDR2 6 2抗血清 ,Wensternblot分析该抗血清与KDR2 6 2蛋白结合的特异性 ;用3 H ... 目的 :分析可溶性KDR(sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。方法 :通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF16 5结合的能力 ;sKDR免疫家兔制备KDR2 6 2抗血清 ,Wensternblot分析该抗血清与KDR2 6 2蛋白结合的特异性 ;用3 H TdR掺入法 ,MTT法和细胞计数 3种方法分析重组sKDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用。结果 :sKDR蛋白可与VEGF16 5特异性结合 ,肝素可增强其结合能力。KDR2 6 2抗血清具有特异性识别KDR蛋白的能力 ,其滴度为 1∶2 0 0 0。用3 H TdR掺入法和MTT 2种方法分析sKDR蛋白及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用结果一致 ,sKDR蛋白浓度在 10 μg/ml,2μg/ml,0 .4μg/ml时对内皮细胞增殖抑制率平均为 5 6 %,44 %和 32 %;抗KDR2 6 2抗体在稀释度为 5 0 ,2 0 0和 80 0倍时对内皮细胞增殖的抑制率平均为 70 %,5 6 %和 43%。细胞计数法测定结果 ,sKDR及抗KDR2 6 2抗体组与VEGF16 5单独刺激组 ,GST和PBS对照组相比 ,内皮细胞增殖被明显抑制 ,随浓度增加抑制活性明显增强 ,但抗体的抑制活性比sKDR蛋白高。结论 :大肠杆菌表达的sKDR及其抗体对内皮细胞均具有明显的增殖抑制作用。 展开更多

关键词 重组可溶性KDR 抗体 内皮细胞 抑制作用 血管内皮细胞生长因子 抗血管形成 细胞增殖

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重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达 被引量：2

4

作者 王梁华 朱玉平 +3 位作者 娄永华 彭燕 冯煜 焦炳华 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期248-251,共4页

目的 :在甲醇营养型酵母 (Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL ,凋亡素 - 2配体 )分子。 方法 :人可溶性 TRAIL编码基因片段插入 p IC 3.5酵母表达载体 ,氯化锂转化酵母 GS115株 ,甲醇诱导表达 5 ... 目的 :在甲醇营养型酵母 (Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL ,凋亡素 - 2配体 )分子。 方法 :人可溶性 TRAIL编码基因片段插入 p IC 3.5酵母表达载体 ,氯化锂转化酵母 GS115株 ,甲醇诱导表达 5 d,SDS- PAGE和 Western- blotting确认表达 ,L 92 9细胞鉴定活性。结果 :发现在酵母细胞中重组表达的 TRAIL在 SDS-PAGE上占总蛋白的 5 0 %以上 ,用抗人 TRAIL多抗可以确认表达了 TRAIL重组分子 ,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的 TRAIL有明显提高 ,并能诱导几株肿瘤细胞 DNA片段化 ,说明 TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论 :在 Pichia系统中正确表达了人可溶性 TRAIL分子。 展开更多

关键词 重组人可溶性凋亡素-2 Pichia表达系统 细胞毒 甲醇营养型酵母

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高盐胁迫渗透对SBD2重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响

5

作者 季勤 张云峰 +2 位作者 罗玉明 徐春 黄翠香 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期70-75,共6页

在基因工程的操作中,包涵体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白质的一大难点.本研究将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)环状糊精糖基转移酶(CGTase)的淀粉粒结合域(SBD)基因编码序列的两个拷贝通过一连接肽连接(SBD2)后,克隆到大肠... 在基因工程的操作中,包涵体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白质的一大难点.本研究将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)环状糊精糖基转移酶(CGTase)的淀粉粒结合域(SBD)基因编码序列的两个拷贝通过一连接肽连接(SBD2)后,克隆到大肠杆菌表达载体pTrcHis B上,得到的pTrcHis B/SBD2质粒转化大肠杆菌Top10,研究了不同培养基、不同诱导温度和时间对SBD2蛋白表达的影响.结果表明,利用相容性溶质山梨醇和甜菜碱等,在高盐胁迫下,实现了SBD2重组蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达,这一结果为在体外研究SBD2蛋白的功能奠定了基础. 展开更多

关键词 SBD重组蛋白 相容性溶质 高渗胁迫 可溶性表达

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表达鸡TRAIL基因的重组5型腺病毒构建

6

作者 金天明 郑世民 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期505-509,共5页

本研究采用RT-PCR从鸡脾细胞扩增到TRAIL基因,测序验证后,将扩增的TRAIL基因开放阅读框克隆到pShuttle-CMV上,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,获得含有TRAIL基因的5型腺病毒重组质粒,进而将PacⅠ线性化重组质粒转染AD-293细胞,... 本研究采用RT-PCR从鸡脾细胞扩增到TRAIL基因,测序验证后,将扩增的TRAIL基因开放阅读框克隆到pShuttle-CMV上,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,获得含有TRAIL基因的5型腺病毒重组质粒,进而将PacⅠ线性化重组质粒转染AD-293细胞,收获重组腺病毒。并对后者进行RT-PCR扩增,获得TRAIL基因片段,经westernblot鉴定显示构建的重组腺病毒可表达TRAIL蛋白,表明TRAIL基因在构建的重组腺病毒rAd5-TRAIL中得到表达。本研究为下一步的动物试验和研究TRAIL基因的抑瘤作用奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡trail基因 同源重组 重组腺病毒

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重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

7

作者 娄永华 焦炳华 +2 位作者 肖扬 朱玉平 王梁华 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期140-142,共3页

目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DN... 目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DNA测序证实后亚克隆入高表达载体 p L OU- 1,转化大肠杆菌 BL 2 1,获得高表达菌株。经 IPTG诱导获得高表达 ,纯化表达产物并检测其对内皮细胞 ECV30 4增殖的抑制活性。 结果 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,约占细菌总蛋白的 4 0 % ;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性。结论 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用 。 展开更多

关键词 血管内皮 聚合酶链反应 血管生长抑制因子 基因表达 重组人可溶性VEGI 大肠杆菌

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重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

8

作者 娄永华 焦炳华 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期143-146,共4页

目的 :克隆人 THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性 THANK。 方法 :采用RT- PCR从 PMA诱导的 HL 6 0细胞中克隆人 THANK全长编码基因 ,继以 PCR扩增出可溶性 THANK编码区基因 (134～2 85位氨基酸 ) ,PC... 目的 :克隆人 THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性 THANK。 方法 :采用RT- PCR从 PMA诱导的 HL 6 0细胞中克隆人 THANK全长编码基因 ,继以 PCR扩增出可溶性 THANK编码区基因 (134～2 85位氨基酸 ) ,PCR产物克隆于 p MD- 18T,经 DNA测序证实后亚克隆到 p ET- 11a中。重组质粒转化 BL 2 1,以 1m mol/ LIPTG进行诱导表达产物 ,SDS- PAGE分析表达产物 ,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性。结果 :RT- PCR扩增出编码人 THANK全长编码基因及 PCR扩增出 THANK1 34 - 2 85基因的 c DNA ,经序列分析证实与文献报道完全一致。含有THANK1 34 - 2 85编码基因的表达载体 ,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约 180 0 0的重组蛋白。该重组蛋白经纯化后能够诱导 U937细胞凋亡。结论 :成功克隆了人 THANK基因 ,并在大肠杆菌中表达重组可溶性 THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导 U937细胞凋亡的作用。 展开更多

关键词 TNF超家族 RT-PCR 基因克隆 基因表达 肿瘤 重组人可溶性THANK 大肠杆菌

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脾内微量注射免疫法制备抗重组可溶性组织因子单克隆抗体 被引量：2

9

作者 蔡旭 彭卓醇 +4 位作者 孔德升 郭泓珅 白浩 宋后燕 马端 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期92-96,共5页

目的制备抗重组可溶性组织因子(r-sTF)单克隆抗体并建立检测组织因子(TF)含量的夹心ELISA法,以期为TF的深入研究及临床应用提供参考依据。方法取微量TF对Balb/c小鼠直接进行脾内注射免疫,分离小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞,融合后对杂交瘤... 目的制备抗重组可溶性组织因子(r-sTF)单克隆抗体并建立检测组织因子(TF)含量的夹心ELISA法,以期为TF的深入研究及临床应用提供参考依据。方法取微量TF对Balb/c小鼠直接进行脾内注射免疫,分离小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞,融合后对杂交瘤细胞进行筛选克隆化培养;建立了3株稳定分泌TF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1-C3、2-G9、3-H9;进而在小鼠体内诱生腹水,并用rprotein A亲合层析法纯化;经鉴定后用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记于其中一株单抗上,建立夹心ELISA法测定正常人血浆中的TF含量。结果纯化的单抗用SDS-PAGE测定纯度,在Mr为150 000左右呈现一条带;Western blot测定显示1-C3、2-G9、3-H9分泌的单抗可特异地识别Mr为47 000的TF,经免疫球蛋白(Ig)类和亚类鉴定实验证实3株单抗均为IgG1;用夹心ELISA法检测正常人血浆中的TF含量为(130±80)pg/mL。结论用脾内微量注射法成功制备抗TF单克隆抗体及ELISA测定TF含量方法的建立,为TF的制备纯化和检测奠定了基础,也使TF的临床深入化研究成为可能。 展开更多

关键词 重组可溶性组织因子 免疫 单克隆抗体

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化学分子伴侣对重组绵羊IFN-tau在大肠埃希菌中可溶性蛋白表达的影响 被引量：4

10

作者 徐晓健 宋长征 吕丽燕 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第1期1-5,共5页

为探索化学分子伴侣对重组绵羊胚胎干扰素(roIFN-tau)在大肠埃希菌中可溶性蛋白表达的影响,以oIFN-tau cDNA为模板PCR法扩增oIFN-tau成熟肽基因后,扩增产物和pBV221表达载体分别用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切、连接,构建表达载体... 为探索化学分子伴侣对重组绵羊胚胎干扰素(roIFN-tau)在大肠埃希菌中可溶性蛋白表达的影响,以oIFN-tau cDNA为模板PCR法扩增oIFN-tau成熟肽基因后,扩增产物和pBV221表达载体分别用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切、连接,构建表达载体,并进行双酶切和测序鉴定。用不同浓度的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、β-环糊精、蔗糖、D-甘露醇、二甲基亚枫、乙醇)于42℃诱导阳性重组菌表达4 h,分别取E.coli上清和沉淀做SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析结果表明,甘油、葡萄糖、β-环糊精、蔗糖、二甲基亚砜对oIFN-tau的表达形式没有影响,而D-甘露醇和乙醇增加了oIFN-tau的可溶性表达,为进一步的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 化学分子伴侣 重组oIFN-tau 可溶性表达

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响应面优化重组大肠杆菌表达RGD-TRAIL发酵工艺 被引量：4

11

作者 曹家明 韦利军 刘福松 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期283-288,共6页

为了提高RGD-TRAIL的表达量,对重组大肠杆菌的发酵工艺进行优化。在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验设计进行了四因素三水平的响应面分析试验,研究了接种体积分数、pH值、诱导时间、诱导温度对RGD-TRAIL表达的影响。响应面结果... 为了提高RGD-TRAIL的表达量,对重组大肠杆菌的发酵工艺进行优化。在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验设计进行了四因素三水平的响应面分析试验,研究了接种体积分数、pH值、诱导时间、诱导温度对RGD-TRAIL表达的影响。响应面结果表明,RGD-TRAIL表达的最佳条件为:接种体积分数7.88%,pH值7.02,诱导时间10.25 h,诱导温度22℃。在此条件下RGD-TRAIL的表达量达到17.27%,与模型预测表达量(17.31%)接近,较优化前提高了40.06%。 展开更多

关键词 重组大肠杆菌 RGD—trail 发酵工艺 响应面优化

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CILP-MBP基因重组蛋白的亚克隆构建及温度可溶性诱生表达

12

作者 姚振宇 吕昌龙 +1 位作者 于秉治 曹雅明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期309-313,共5页

目的：构建Cartilage Intermediate Layer Protein（CILP)基因组后半部分（C2)亚克隆可溶性重组蛋白表达系统。方法：应用基因克隆技术，提取C2的3个首尾互相重叠的小片段的目的基因（C2F1，C2F2，C2F3），将其重新克隆到pMAL-eHis表达... 目的：构建Cartilage Intermediate Layer Protein（CILP)基因组后半部分（C2)亚克隆可溶性重组蛋白表达系统。方法：应用基因克隆技术，提取C2的3个首尾互相重叠的小片段的目的基因（C2F1，C2F2，C2F3），将其重新克隆到pMAL-eHis表达载体中，分别命名为C2F1，C2F2，C2F3-MBP，并尝试在用化学诱导（IPTC）的同时，用不同的温度（22℃，30℃，37℃）来诱导重组基因表达可溶性重组蛋白。结果：重新构建表达载体后，经过异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）化学诱导，在各种诱导温度下重组载体均可表达目的基因蛋白，但在30℃下有大量的可溶性蛋白表达，而在37℃时，重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达，22℃时蛋白不能被充分诱生表达。基因测序和 SDS-PAGE，Western Blot结果均表明这3种重组蛋白含有目的基因和羧基末端的6个组氨酸残基，从而为下一步的亲合层析提供了便利条件。结论：成功构建了C2部分的3个小片段的可溶性MBP融合蛋白表达载体，从而为进一步研究CILP，功能提供了重要的工具。 展开更多

关键词 CILP 重组蛋白 亚克隆 CILP-MBP 基因表达 温度可溶性 类风湿性关节炎

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TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究 被引量：5

13

作者 薛胜利 冯作化 +3 位作者 张桂梅 张慧 黎培员 李东 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2002年第3期158-162,共5页

目的 :构建鼠源TRAIL(mTRAIL)真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用 ,抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH5 10协同抑制肝癌生长作用。方法 :采用RT PCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒 ;体内... 目的 :构建鼠源TRAIL(mTRAIL)真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用 ,抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH5 10协同抑制肝癌生长作用。方法 :采用RT PCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒 ;体内、外进行基因转染 ;用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率 ,用TdT mediateddUTPnickendlabeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡 ;小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。结果 :用RT PCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA ,并克隆至真核表达载体pcDNA3 .1中获重组质粒pX1;以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H2 2细胞 ,可检测到肝癌细胞凋亡 ;肌肉内注射转染质粒DNApX1,通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长 ;pX1与FN多肽真核表达质粒pCH5 10有协同抑制肝癌生长作用。结论 :质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达 ;体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长 ;与FN多肽真核表达质粒pCH5 展开更多

关键词 真核表达 trail 重组FN多肽 肝癌 基因治疗 质粒

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融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展 被引量：15

14

作者 吴珊珊 朱芸 +1 位作者 陈珊珊 何冰芳 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第4期993-998,共6页

融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白... 融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白折叠中的作用,其中大多数功能较强的融合标签(如MBP和NusA)作为分子伴侣帮助重组蛋白正确折叠从而提高蛋白质可溶性。此外,阐述了实际应用中常用的组合标签和标签的去除。最后提出了融合标签在大规模生产可溶性蛋白质中的应用前景、面临的挑战,以及今后研究的方向。 展开更多

关键词 生物技术 蛋白 溶解性 融合标签 重组蛋白质 可溶性表达 纯化

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截短人胱硫醚β-合成酶的可溶性表达、纯化及活性鉴定 被引量：3

15

作者 王利群 顾雅平 +5 位作者 曹利民 汪庆 于海燕 奚学志 孙培培 沈关心 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期697-703,共7页

目的构建截短人胱硫醚β-合成酶(T-hCBS)基因原核表达载体,得到可溶性的T-hCBS蛋白,为同型半胱氨酸检测试剂盒的开发打下基础。方法通过优化T-hCBS基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/T-hCBS,转化大肠埃希菌BL21。使用Ni 2+亲和层析柱... 目的构建截短人胱硫醚β-合成酶(T-hCBS)基因原核表达载体,得到可溶性的T-hCBS蛋白,为同型半胱氨酸检测试剂盒的开发打下基础。方法通过优化T-hCBS基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/T-hCBS,转化大肠埃希菌BL21。使用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,再通过HiTrap脱盐柱脱盐,采用比色法检测目的蛋白活性。结果重组蛋白在大肠埃希菌中可以高效表达,产量为44mg/L,比活约1 100U/mg。15%SDS-PAGE显示其相对分子质量为45kD,与预计大小一致。表达菌体超声破碎后上清及纯化的蛋白溶液均呈现红色。结论成功克隆和表达了T-hCBS蛋白,并得到高产高酶活性的可溶性蛋白,对同型半胱氨酸检测试剂盒的开发有一定的潜在应用价值。 展开更多

关键词 胱硫醚Β-合成酶 重组 可溶性蛋白 表达

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重组海参溶菌酶工程菌发酵及表达产物纯化和性质的研究 被引量：4

16

作者 王丹 丛丽娜 +1 位作者 谢三群 张欢 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期187-192,共6页

旨在研究重组海参i型溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)可溶性表达的发酵条件、纯化及生物学性质。采用摇瓶发酵的培养方式,分别从培养基组分和发酵条件两个方面对获得可溶性重组SjLys进行研究。表达产物通过亲和层析纯化以... 旨在研究重组海参i型溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)可溶性表达的发酵条件、纯化及生物学性质。采用摇瓶发酵的培养方式,分别从培养基组分和发酵条件两个方面对获得可溶性重组SjLys进行研究。表达产物通过亲和层析纯化以及凝胶过滤层析脱盐,获得了电泳纯为95%的重组SjLys蛋白。进一步对其生物学活性分析,结果表明该酶最适温度为45℃,最适pH值为6.8,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广谱抑菌作用。上述结果将为海参溶菌酶进行产业化奠定应用基础。 展开更多

关键词 可溶性 蛋白纯化 酶活性 溶菌酶 重组表达

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抑制c-FLIP_L表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究 被引量：3

17

作者 谭岩 刘磊 +1 位作者 方艳秋 蒋永兴 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期890-893,共4页

目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的m... 目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的mRNA和蛋白表达的变化。Western blot法检测caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,MTT法检测联合应用RNAi+rhTRAIL和他莫昔芬+rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性。结果:特异性siRNA片段能显著降低A549细胞中c-FLIPL的mRNA水平和蛋白水平。他莫昔芬可以显著抑制c-FLIPL蛋白的表达。两者均可以实现caspase-8的活化,并促进rhTRAIL对A549细胞诱导凋亡作用,凋亡率从2.52%提高到64.5%和59.2%(P<0.05),他莫昔芬和siRNA均可显著促进rhTRAIL蛋白对A549细胞的增殖抑制作用,抑制率分别提高到73.2%和69.5%(P<0.05)。结论:靶向抑制FLIP蛋白表达能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的研究应用。 展开更多

关键词 重组trail蛋白 凋亡抑制基因FLIP A549细胞株 非小细胞肺癌

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人可溶性4-1BB蛋白分子表达载体的构建 被引量：1

18

作者 沈丽琴 徐颖 张学光 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期80-81,共2页

4-1BB分子是近年来发现的一种共刺激分子,属肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)超家属成员,表达于活化的T淋巴细胞表面,以CD8+T细胞为主.

关键词 可溶性4-1BB 表达载体 逆转录-聚合酶链反应 重组表达质粒

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Akt磷酸化在A549细胞抵抗rsTRAIL蛋白诱导细胞凋亡的研究

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作者 刘磊 方艳秋 +3 位作者 齐亚灵 芦小单 魏海峰 谭岩 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期630-632,638,共4页

目的:研究Akt磷酸化抵抗rsTRAIL蛋白诱导肺癌A549细胞株凋亡的作用机制。方法:rsTRAIL蛋白和哌立福新单独和联合作用于细胞株A549,Western blot检测A549细胞中Akt磷酸化水平变化、c-FLIPLL表达水平变化、caspase-8蛋白活化变化情况。流... 目的:研究Akt磷酸化抵抗rsTRAIL蛋白诱导肺癌A549细胞株凋亡的作用机制。方法:rsTRAIL蛋白和哌立福新单独和联合作用于细胞株A549,Western blot检测A549细胞中Akt磷酸化水平变化、c-FLIPLL表达水平变化、caspase-8蛋白活化变化情况。流式细胞术进行细胞凋亡检测。MTT法检测A549细胞增殖率。结果:Western blot结果显示,rsTRAIL蛋白可以导致A549细胞中Akt磷酸化水平的增加,哌立福新能够抑制A549细胞中Akt的磷酸化水平及c-FLIPLL表达水平,增强A549细胞中caspase-8的活化。哌立福新能提升rsTRAIL蛋白诱导A549细胞的细胞凋亡率至(76.5±3.02)%和杀伤活性到(83.2±2.54)%。结论:Akt磷酸化是导致A549细胞对抵抗rsTRAIL诱导细胞凋亡的重要原因,抑制其活性可以促进rsTRAIL蛋白发挥抗NSCLC的活性。 展开更多

关键词 A549细胞株 重组trail蛋白 哌立福新

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人可溶性CD_(14)基因在CHO细胞中的表达

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作者 白洁 荫俊 +3 位作者 王占东 王威 王忠泽 宋伟 《白求恩医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期232-234,共3页

目的 :将人可溶性 CD14 重组基因 ,用真核表达系统进行表达 ,为进一步研究 CD14 的功能打下基础。方法 :用 PCR方法扩增 s CD14 34 8aa片段 ,将产物与载体 p EF1/ His C酶切 ,纯化 ,连接后克隆至大肠杆菌 DH5α中 ,酶切鉴定 ;将重组质粒... 目的 :将人可溶性 CD14 重组基因 ,用真核表达系统进行表达 ,为进一步研究 CD14 的功能打下基础。方法 :用 PCR方法扩增 s CD14 34 8aa片段 ,将产物与载体 p EF1/ His C酶切 ,纯化 ,连接后克隆至大肠杆菌 DH5α中 ,酶切鉴定 ;将重组质粒 p EF1/ His C/ s CD14 34 8aa用脂质体转染法转染至 CHO细胞中 ,用SDS- PAGE、Westen- Blot方法进行检测。结果 :阳性重组子可以切出 10 4 4 bp大小的片段 ,得到重组质粒 p EF1/ His C/ s CD14 34 8aa;转染后的 CHO细胞裂解液 ,Westen- Blot在大小约 530 0 0附近有一条较强的特异性棕色条带 ,说明 s CD14 34 8aa基因在 CHO细胞中得到表达。在 CD14 的 N端有 5个潜在的糖基化位点 ,经真核系统表达 ,表达产物分子量与文献报道基本一致 ,证明重组蛋白糖基化完全。结论 :重组质粒p EF1/ His C/ s CD14 展开更多

关键词 人可溶性CD14 基因克隆 真核表达 CHO细胞 重组质粒

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