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题名突变型聚酮合成酶酮还原酶域的表达及序列分析
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作者
李凌凌
吕早生
李涛
沈辉
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机构
武汉科技大学化学工程与技术学院
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出处
《化学与生物工程》
CAS
2011年第8期36-42,共7页
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基金
湖北省科技厅基金项目(2009CAD006)
武汉科技大学校基金资助项目(2006XY14)
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文摘
为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域EryKR1中的控制底物特异性位点,以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出α6和α7之间的氨基酸残基RHGVIEMP对应的核苷酸序列被替换的EryKR1酶域DNA片段eryKR1M,并克隆到表达载体pET-28a上,构建了质粒pET-ery KR1M,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-ery KR1M)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析表明重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-eryKR1M)中的重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的5.7%。E.coli BL21(pET-ery KR1M)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组菌E.coliBL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示突变型的重组菌E.coli BL21(pET-ery KR1M)失去野生型重组菌E.coliBL21(pET-ery KR1)2还原环己酮的能力,结合EryKR1酶域与放线菌素聚酮还原酶ActKR的氨基酸序列比对和二维结构比较的结果,推测α6和α7间氨基酸残基RHGVIEMP为EryKR1酶域中的底物结合口袋组成单元,对酶活性保持非常重要。
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关键词
酮还原酶域
聚酮合成酶
糖多孢红霉菌
生物催化
序列分析
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Keywords
ketoreductase domain
polyketide synthase
Saccharopolyspora erythraea
biocatalysis
sequenceanalysis
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分类号
Q789
[生物学—分子生物学]
Q815
[生物学—生物工程]
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