随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法...随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。展开更多
目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别...目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平。结果在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常。而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达最高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05)。结论BMP-2mRNA SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低。展开更多
目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taq...目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。展开更多
文摘随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。
文摘目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。
文摘目的:构建重组质粒作为标准阳性模板,建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法:以致病性沙门氏菌inv A基因上特异性片段为目标,设计并合成引物和Taq Man探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果:构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒,能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板,标准曲线方程为Y=-3.151 lg X+42.86(R2=0.999),灵敏度80拷贝反应体系,能特异区分沙门氏菌与类型的细菌,同时,批内和批间的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。结论:本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。
