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逆转录病毒载体介导的GFP基因在四种细胞株中的表达 被引量：23
1
作者 郭志兵 黄洪莲 +1 位作者 刁志宏 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期349-350,共2页
关键词 GFP 逆转录病毒载体 报道基因 转染
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携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究 被引量：15
2
作者 陈香梅 徐开林 +3 位作者 潘秀英 李振宇 鹿群先 李德鹏 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期641-644,共4页
为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN... 为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白基因 T细胞 基因转移
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人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达 被引量：7
3
作者 陈永井 施勤 +5 位作者 葛彦 徐宽枫 古涛 孙建军 李文香 张学光 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第2期110-114,共5页
目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93... 目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 PD-L1 基因克隆 逆转录病毒载体 构建 稳定表达
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白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究 被引量：8
4
作者 王琳 陆荫英 +3 位作者 成军 于敏 李克 刘妍 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第8期699-701,共3页
研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病... 研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病毒载体pLXSN IL 18,转染PA317细胞 ,以逆转录巢式RT PCR方法 ,验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL 18的表达 ,将假病毒颗粒感染 2 .2 .15细胞 ,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBVDNA。成功克隆出 5 80bp的小鼠IL 18全基因并构建逆转录病毒载体 ,在转染PA317细胞的上清中检测出含IL 18假病毒颗粒 ,上清感染 2 .2 .15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到14天时HBsAg已变为阴性 ,对HBVDNA有明显抑制作用。IL 18能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 白细胞介素18 逆转录病毒载体 基因治疗 乙型肝炎病毒感染 逆转录聚合酶链反应
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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 被引量：9
5
作者 李炯 刘艳红 +4 位作者 安芳兰 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期376-382,共7页
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病... 为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳前体基因 绿色荧光蛋白基因 BHK-21细胞
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达 被引量：9
6
作者 傅建新 王玮 +2 位作者 卢大儒 岑建农 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期261-265,共5页
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交... 逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 基因表达 构建
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含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建 被引量：10
7
作者 崔龙 曹广文 +6 位作者 王元和 屠岳 孟荣贵 高军 仇小芳 吴宗娣 谢苏庆 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期289-291,共3页
含ＣＤ基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇小芳，吴宗娣，谢苏庆关键词大肠癌；胞嘧啶脱氨酶基因；逆转录病毒载体；癌胚抗原；转录调控序列胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）是真菌及某些大肠... 含ＣＤ基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇小芳，吴宗娣，谢苏庆关键词大肠癌；胞嘧啶脱氨酶基因；逆转录病毒载体；癌胚抗原；转录调控序列胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）是真菌及某些大肠杆菌等ＤＮＡ嘧啶补救合成途径中的关... 展开更多
关键词 大肠肿瘤 CD基因 逆转录病毒载体 病毒载体
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绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达 被引量：7
8
作者 刘德莉 胡晓洁 +2 位作者 吴娟娟 刘伟 曹谊林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期424-425,438,共3页
目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细... 目的　实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法　构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果　转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论　构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。 展开更多
关键词 重组逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 细胞标记 GFP
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核骨架基质结合区(S/MAR)提高逆转录病毒载体介导egfp在NIH3T3细胞中的表达 被引量：10
9
作者 戴冰冰 梅文瀚 +2 位作者 王家敏 钱关祥 卢健 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期24-30,共7页
为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表... 为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 .结果显示 :反向和正向的S MAR在瞬时表达的情况都不能提高egfp的表达 ,但在稳定整合的情况下反向S MAR可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 ,而正向的S MAR作用不明显 ,另外反向S MAR可明显提高MFG逆转录病毒载体的滴度约 5倍 ;因此改造后的MFG逆转录病毒载体将能更好地用来介导外源治疗基因的表达 .同时还观察到 ,同一个载体骨架在稳定表达的情况下 ,磷酸钙介导较逆转录病毒载体介导的表达水平高 . 展开更多
关键词 核骨架基质结合区 逆转录病毒载体 基因沉默
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人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用 被引量：5
10
作者 章卫平 曹雪涛 +4 位作者 马施华 黄欣 张明徽 陶群 叶天星 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第1期26-32,共7页
利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包... 利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 人G-CSF基因 克隆 重组逆转录病毒载体 构建 应用 粒细胞集落刺激因子 基因治疗
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高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较 被引量：8
11
作者 刘希民 达万明 +1 位作者 张苗 靳海杰 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第4期268-268,共1页
关键词 小鼠 脾脏 T细胞 基因转染率 高滴度逆转录病毒载体 衣霉素
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反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定 被引量：4
12
作者 段德义 张海燕 +2 位作者 徐群渊 李颖 杨慧 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期103-107,共5页
为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行... 为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。 展开更多
关键词 反义HLA-A2 GDNF 基因表达 逆转录病毒载体 PARKINSON病 神经退行性疾病 人成纤维细胞 基因治疗
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雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定 被引量：4
13
作者 王洛夫 江军 +2 位作者 方玉华 靳风烁 靳文生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期641-643,共3页
目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和... 目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。 展开更多
关键词 雄激素受体 反义RNA 逆转录病毒载体 pL-AR-SN 前列腺癌
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逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状 被引量：4
14
作者 唐南洪 王晓茜 +3 位作者 陈燕凌 李秀金 殷凤峙 朱金海 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期146-148,共3页
目的　　建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。　方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的... 目的　　建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。　方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ　ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２　０００　ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０　ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０　ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 白细胞介素2 肝细胞 基因转移 肝癌
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PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究 被引量：5
15
作者 闫国和 杨余亮 +6 位作者 侯爱莲 王锋超 许庆娥 熊玮 程天民 王军平 粟永萍 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第21期2024-2028,共5页
目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bM... 目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 血小板衍生生长因子A链基因 骨髓间充质干细胞 稳定表达
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人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：3
16
作者 章卫平 曹雪涛 +3 位作者 王建莉 马施华 黄欣 于益芝 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1996年第3期186-190,共5页
通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤... 通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA．并经核苷酸测序加以证实，将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN，构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2．体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10^4CFU／ml,NIH 3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后．分泌IL-2水平达118.2U／ml；PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段．提示重组逆转录病毒载体已整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础. 展开更多
关键词 人白细胞介素2 重组逆转录病毒载体 构建 表达 基因治疗 肿瘤瘤苗
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细胞同步化能显著提高逆转录病毒载体的转染效率 被引量：4
17
作者 杨金亮 黄晋生 +1 位作者 房殿春 张海荣 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期34-34,38,共2页
关键词 细胞培养 低温处理 同步化 逆转录病毒载体 转染效率 基因治疗
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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：3
18
作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页
本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多
关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞 稳定表达
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人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定 被引量：3
19
作者 贺伟峰 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 马兵 雷晓 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期782-785,共4页
目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果　成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 CTLA4IG基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒 双基因共表达 基因重组 脂质体法 增强型绿色荧光蛋白
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逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用 被引量：3
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作者 刘扬 马淑梅 +6 位作者 刘晓冬 金顺子 徐瑞明 武宁 赵银龙 龚守良 刘树铮 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期228-231,共4页
目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人... 目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。 展开更多
关键词 RNA干扰 基因 p53 逆转录病毒载体 SHRNA
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