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大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)逆转录病毒周期蛋白(OrfA)相互作用蛋白的酵母双杂交筛选 被引量：5
1
作者 徐坤 王亮亮 +3 位作者 张婷婷 周罡 张志强 张智英 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期267-275,共9页
大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称... 大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称为逆转录病毒周期蛋白(retroviral-cyclin).为了深入研究OrfA的作用和功能,我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA,采用酵母双杂交技术,从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子.通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析,最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5.OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用.这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础. 展开更多
关键词 大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒 逆转录病毒周期蛋白(orfa) 酵母双杂交 E2F5转录因子
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人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响
2
作者 江汕 冯振卿 +3 位作者 江千里 李玉华 彭韬 印虹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期29-32,共4页
目的：构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体（RV），观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法：将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中，经酶切和测序鉴定，制备高滴度的RV，以流动感染法高效感染，半固体集落培养法测... 目的：构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体（RV），观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法：将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中，经酶切和测序鉴定，制备高滴度的RV，以流动感染法高效感染，半固体集落培养法测定基因导入率：用嘌呤霉素筛选后，获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照，用PCR鉴定基因的导入，并测定细胞周期及凋亡率等，研究plk3基因导入对细胞的影响：结果：获得pMSCV—plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率，分别达82．3％±3．70%和62．9％±4．94％（n=3）。经嘌呤霉素筛选后，转基因细胞的阳性率〉99％。K562-plk3-puroR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低（P〈0．01）；而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异．与K562细胞相比较，常规培养时，处于G0～G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[（49．7±3．38）％vs（43．9±2．34）％，P=0．03]．以无血清培养堆培养10h后，进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[（43．6±3．74）％vs（54．5±1．52）％，P=0．02]，凋亡率降低[（1．3±0．31）％vs（3．4±0．37）％，P=0．01]，结论：构建了plk3基因的逆转录病毒载体，发现plk3基因的导入叮延缓细胞增殖，并抑制细胞进入增殖周期. 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 plk3基因 细胞周期 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族
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OrfA与E2F5的互作关系及其对肺腺癌细胞增殖的影响
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作者 穆璐 张潇筠 +3 位作者 韩宝泉 陈昱光 张智英 徐坤 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第12期11-17,27,共8页
【目的】确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响。【方法】采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A... 【目的】确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响。【方法】采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A375恶性黑色素瘤细胞、SMMC-7721肝癌细胞和SPC-A-1肺腺癌细胞中E2F5的表达量;通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验,验证OrfA与E2F5的互作关系;采用CCK-8试剂盒和PI单染色法,检测过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖的影响;采用RT-qPCR,检测过表达orfA基因对SMAD4和caspase-3基因表达的影响。【结果】成功构建了orfA与E2F5基因过表达载体pLenti-EF1α-orfA和pLenti-EF1α-E2F5;在5种细胞系中,以SPC-A-1细胞E2F5蛋白表达量最高;酵母双杂交和免疫共沉淀试验结果均证明,OrfA与E2F5可以直接相互作用;过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖具有显著促进作用,同时能够增强SMAD4基因的表达,抑制caspase-3基因的表达。【结论】WDSV OrfA与E2F5有相互作用,且能促进SPC-A-1肺腺癌细胞的增殖。 展开更多
关键词 逆转录病毒周期蛋白(orfa) E2F5转录因子 SPC-A-1肺腺癌细胞 细胞增殖
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