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猪内源性逆转录病毒检测的三重PCR方法的建立及其在五指山猪组织样品检测中的初步应用
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作者 瑞雪 张云航 +7 位作者 李杨 谭晨 蔡艺菲 刘园园 曹宗喜 张艳 孙瑞萍 刘光亮 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3548-3554,共7页
本研究旨在建立可同时检测猪基因组中的猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)并鉴别PERV-A、PERV-B、PERV-C三种亚型PERV的三重PCR检测方法。根据PERV不同亚型囊膜(env)基因设计特异性引物,经反应条件和反应体系优... 本研究旨在建立可同时检测猪基因组中的猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)并鉴别PERV-A、PERV-B、PERV-C三种亚型PERV的三重PCR检测方法。根据PERV不同亚型囊膜(env)基因设计特异性引物,经反应条件和反应体系优化后对该方法进行特异性、敏感性及重复性试验验证。结果表明:本研究建立的三重PCR检测方法特异性强,可特异性扩增三种亚型PERV目的基因,对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒扩增结果呈阴性;该方法的敏感性较好,对PERV-A、PERV-B、PERV-C质粒标准品的检测下限分别为1×10^(2)、1×10^(3)和1×10^(2)拷贝·μL^(-1);采用建立的三重PCR方法检测103份组织样品,其中PERV-A的阳性率为100%(103/103),PERV-B的阳性率为100%(103/103),PERV-C的阳性率为54%(56/103),与经典单重PCR方法进行比较,符合率分别为100%、100%、96.6%。本研究成功建立了一种特异性强、敏感性较好、快速简便的三重PCR方法,可用于PERV三种亚型同时检测的鉴别诊断,为筛选无PERV的猪源供体器官提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪内源性逆转录病毒 囊膜基因 三重PCR检测方法 组织样品
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南通市HIV合并HBV感染者抗逆转录病毒疗效及影响因素分析 被引量:1
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作者 潘一茹 邱涛 +9 位作者 马平 周小毅 丁萍 陈彦君 姜洁 何楚 钱姣 孔泉 邹美银 翟祥军 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2024年第7期972-978,共7页
目的:了解人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染现况和特征,分析HIV/HBV合并感染者抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)效果及影响因素。方法:选取南通... 目的:了解人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染现况和特征,分析HIV/HBV合并感染者抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)效果及影响因素。方法:选取南通市2016年1月—2021年12月新确诊的HIV感染者为调查对象,根据乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)检测结果分为HIV单独感染组1 830例和HIV/HBV合并感染组135例,比较两组患者ART前HIV感染特征,分析ART后HIV病毒学抑制和CD4+T淋巴细胞变化情况,以评估免疫功能改善情况及影响因素。结果:HIV/HBV合并感染者ART前免疫受损重于HIV单独感染者。接受ART后,HIV单独感染组和HIV/HBV合并感染组的CD4+T计数总体上均随治疗时间延长呈上升趋势,ART 2年后,两组患者的HIV病毒学抑制率均为90%以上。单因素和多因素Logistic回归分析均显示开始ART的年龄增加、初始CD4+T <200个/μL、初始HIV RNA≥4.5[lg(copies/mL)]是影响免疫重建的危险因素。随治疗时间的延长,免疫重建良好率有增加趋势。在ART前合并HBV感染加重HIV感染者的免疫损伤,因而可能影响免疫重建。结论:HBV感染可加重HIV感染者的免疫损伤,现行HIV/HBV合并感染的ART策略可有效抑制双重感染,有利于HIV/HBV合并感染者的免疫重建。在感染者的干预管理中,ART及疗效监测均存在不足,临床诊疗活动需进一步规范。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 乙型肝炎病毒 合并感染 逆转录病毒治疗
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超高效液相色谱-串联质谱法同时测定5种抗逆转录病毒药物血药浓度 被引量:2
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作者 张晓颖 叶珍洁 +2 位作者 吴灵洁 原津津 俞晓玲 《医药导报》 北大核心 2024年第2期207-214,共8页
目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定人血浆中多替拉韦、拉替拉韦、依非韦伦、拉米夫定和替诺福韦浓度,并应用于治疗药物监测。方法分别以多替拉韦-D5、拉替拉韦-D4、依非韦伦-D5、拉米夫定-^(13)C-^(15)N_(2)、替... 目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定人血浆中多替拉韦、拉替拉韦、依非韦伦、拉米夫定和替诺福韦浓度,并应用于治疗药物监测。方法分别以多替拉韦-D5、拉替拉韦-D4、依非韦伦-D5、拉米夫定-^(13)C-^(15)N_(2)、替诺福韦-D7作为内标,样本经乙腈沉淀蛋白法处理后稀释进样分析。色谱柱为Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0 mm×50 mm,1.6μm),流动相为0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱,流速为0.3 mL·min^(-1),柱温40℃。采用电喷雾离子源,正离子-多反应监测模式扫描分析,待方法学验证后用于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者治疗药物监测。结果多替拉韦、拉替拉韦、依非韦伦、拉米夫定、替诺福韦血药浓度分别在62.5~3000、10~500、125~6000、10~500、10~500 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好,线性相关系数(R^(2))均>0.998;四水平质控样品的日内和日间精密度RSD<7%,准确度为94.0%~109.3%;提取回收率为98.7%~104.5%、不同类型血浆基质效应为95.7%~106.0%,且血浆样本在一定的储存环境中稳定性良好。临床样本检测结果显示接受多替拉韦、依非韦伦、拉米夫定、替诺福韦的HIV患者血药谷浓度分别为107.7~2366.0、740.0~3410.0、38.5~1229.3、31.6~224.4 ng·mL^(-1)。结论该方法准确度高、操作简便、成本低,适用于HIV患者多替拉韦、拉替拉韦、依非韦伦、拉米夫定、替诺福韦的治疗药物监测。 展开更多
关键词 多替拉韦 拉替拉韦 依非韦伦 拉米夫定 替诺福韦 逆转录病毒药物 治疗药物监测 超高效液相色谱-串谱质谱法
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人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定 被引量:3
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作者 贺伟峰 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 马兵 雷晓 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期782-785,共4页
目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 CTLA4IG基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒 双基因共表达 基因重组 脂质体法 增强型绿色荧光蛋白
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四川山鹧鸪基因组中内源性逆转录病毒的分析 被引量:1
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作者 郑帅 周闯 +3 位作者 范振鑫 李静 岳碧松 孟杨 《四川动物》 北大核心 2019年第5期521-525,共5页
内源性逆转录病毒(ERV)是插入到宿主基因组中的、可以稳定遗传的病毒基因组,能够在宿主体内表达和复制,调节插入位点附近的基因表达,以及抑制同源病毒的感染。从四川山鹧鸪Arborophila rufipectus基因组中确定了3 962个全长ERV拷贝,其中... 内源性逆转录病毒(ERV)是插入到宿主基因组中的、可以稳定遗传的病毒基因组,能够在宿主体内表达和复制,调节插入位点附近的基因表达,以及抑制同源病毒的感染。从四川山鹧鸪Arborophila rufipectus基因组中确定了3 962个全长ERV拷贝,其中4个具有完整的结构,72个具有自我复制的能力,554个含有gag、pol或env基因所编码的蛋白质结构域。根据逆转录酶序列的相似性,确定了7个ERV家族,并依据与其他物种的相似性对家族进行了命名。其中,AruERV-L包含122个ERV拷贝,为拷贝数最多的家族。7个ERV家族的年龄分布在0~12百万年,其中AruERV-K1是最年轻的家族,其约86%的拷贝年龄在1百万年以内。 展开更多
关键词 四川山鹧鸪 基因组 内源性逆转录病毒 内源性逆转录病毒家族 内源性逆转录病毒年龄
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PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究 被引量:17
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作者 胡亮 钱关祥 +3 位作者 沈文红 许伟榕 张腾飞 陈诗书 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1995年第3期235-238,217,共5页
逆转录病毒介导的基因转移技术要过渡到临床应用,主要解决如何使病毒载体具有高滴度而不具有复制活性。本文旨在探索建立一种合适的方法,能产生高滴度而且是安全的逆转录病毒载体。采用带有人肿瘤坏死因子基因的LXSN载体转染PA317包装细... 逆转录病毒介导的基因转移技术要过渡到临床应用,主要解决如何使病毒载体具有高滴度而不具有复制活性。本文旨在探索建立一种合适的方法,能产生高滴度而且是安全的逆转录病毒载体。采用带有人肿瘤坏死因子基因的LXSN载体转染PA317包装细胞,建立产病毒的包装细胞株,结果表明:病毒载体滴度受包装培养液体积和胎牛血清浓度影响;包装细胞在32℃产生的病毒滴度比37℃高,而且比较稳定。产病毒包装细胞和被感染的靶细胞经PCR分析显示,被转染和被转导的细胞都有病毒基因的整合,而且包装细胞不会产生具有复制活性的逆转录病毒,因此能进一步用于临床研究。 展开更多
关键词 包装细胞 逆转录病毒 TNF-Α基因 高滴度 病毒载体 临床应用 转染 PA 基因转移技术 复制
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湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的研究 被引量:13
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作者 邢晓为 薛立群 +2 位作者 黄生强 黎淑娟 王维 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期799-804,共6页
为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据,从湖南沙子岭猪的保种群内随机采集31头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵... 为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据,从湖南沙子岭猪的保种群内随机采集31头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。多组织RT-PCR检测3头沙子岭猪肾、心、肝、肺、脾等组织中PERV的表达情况,了解其在各组织中的分布情况;最后,扩增、测序该猪种的env基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析。PCR和RT-PCR结果表明,所检测的31头沙子岭猪均带有PERV前病毒DNA,耳样组织中均有PERV mRNA表达,其中有2头个体携带env-A、env-B、env-C3种囊膜蛋白基因,而其余的29头个体只带有env-Ae、nv-B两种囊膜蛋白基因,未检测到env-C基因。多组织RT-PCR扩增结果表明,3头沙子岭猪的肾、心、肝、肺、脾等组织中,pol、gage、nv-A、env-B基因均有表达,未检测到env-C基因表达。测序沙子岭猪的env基因,结果发现,沙子岭猪env-B和env-C基因与其他猪种序列比较分别存在2和10个碱基的差异,而env-A基因序列没有差异,说明不同的猪种之间env基因存在多态性。以上结果表明,沙子岭猪种群携带PERV,其亚型主要以PERV-A,B为主;PERV在该猪种肾、心、肝、肺、脾等多种组织中的分布没有明显组织特异性,且93.5%(29/31)个体表现为env-C基因缺失,提示沙子岭猪作为候选猪种可能在异种移植中具有较好的应用前景。 展开更多
关键词 猪内源性逆转录病毒 亚型 沙子岭猪 异种移植 组织分布
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逆转录病毒载体介导的GFP基因在四种细胞株中的表达 被引量:23
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作者 郭志兵 黄洪莲 +1 位作者 刁志宏 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期349-350,共2页
关键词 GFP 逆转录病毒载体 报道基因 转染
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当归多糖硫酸酯抗小鼠L6565逆转录病毒的作用 被引量:12
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作者 贾敏 姚秀娟 +2 位作者 杨铁虹 孟静茹 梅其炳 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期93-97,共5页
目的 观察当归多糖硫酸酯(APS)抗小鼠L65 65逆转录病毒的作用,以探讨其治疗艾滋病的可能性。方法 用小鼠L65 65病毒感染出生2 4h内的乳鼠建立模型;以RT PCR法测定血浆病毒载量;流式细胞术测定CD4 +,CD8+细胞的百分数,计算CD4 +/CD8+... 目的 观察当归多糖硫酸酯(APS)抗小鼠L65 65逆转录病毒的作用,以探讨其治疗艾滋病的可能性。方法 用小鼠L65 65病毒感染出生2 4h内的乳鼠建立模型;以RT PCR法测定血浆病毒载量;流式细胞术测定CD4 +,CD8+细胞的百分数,计算CD4 +/CD8+细胞的比值;镜检计数外周血白细胞、红细胞和骨髓有核细胞数;测定脾脏、胸腺的重量并计算脏体系数。结果 与正常对照组相比,模型组小鼠血浆病毒载量较高( 4 1 65±1 98) ,CD4 +细胞百分率( 1 8.2±4 .9)、红细胞、骨髓有核细胞数及胸腺系数显著降低,而白细胞数和脾脏系数显著升高(P <0 .0 5或P <0 .0 1 ,n =1 0 ) ;与模型组相比,APS在1 0和3 0mg·kg- 1 剂量下血浆病毒载量显著降低( 3 3 2 8±1 0 3和3 3 94±1 71 ) ,CD4 +细胞百分率( 5 2 .6±5 .8和5 7.0±5 .5 ) ,CD4 +/CD8+比值( 3 .6±0 .6和3 .4±0 .5 )、红细胞、骨髓有核细胞数及胸腺系数显著升高,白细胞数和脾脏系数显著降低(P <0 .0 5或P <0 .0 1 ,n =1 0 )。结论 APS不仅具有一定的抗病毒作用,而且对免疫功能有一定的调节作用。 展开更多
关键词 当归多糖硫酸酯 逆转录病毒 免疫调节 病毒载量
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艾滋病7年高效抗逆转录病毒治疗的多中心前瞻性观察 被引量:22
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作者 郑煜煌 周华英 +9 位作者 何艳 邓晓军 朱章萍 符政远 申红连 王建国 王为德 文森 黎雪峰 郑力文 《中国感染控制杂志》 CAS 2010年第5期310-315,共6页
目的前瞻性长期观察人免疫缺陷病毒感染者和获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)患者的高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)一线药物抗HIV及免疫重建效果和主要毒副反应,探索我国艾滋病长期抗病毒治疗的规律... 目的前瞻性长期观察人免疫缺陷病毒感染者和获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)患者的高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)一线药物抗HIV及免疫重建效果和主要毒副反应,探索我国艾滋病长期抗病毒治疗的规律。方法 437例HIV/AIDS患者先后启动HAART,一线方案为2个核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)加1个非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)。随访监测CD4+T细胞数量、HIV病毒载量,追踪血常规和主要生化指标的变化;观察发生的机会感染和药物毒副反应并及时处理,对出现病毒学失败或严重毒副反应者及时调整用药。结果对437例接受HAART的HIV/AIDS患者平均追踪了4.69年(3.15~7.34年),总病死率6.86%,大部分死亡发生在HAART启动的6个月内。启动HAART 12个月时,90.80%的患者HIV载量小于可检测下限;至治疗4、5、6、7年(±1个月)时,仍分别有63.46%、69.41%、70.00%和72.22%的患者病毒载量小于可检测下限。CD4+细胞数量在治疗的O、1、2、3、4、5、6、7年(±1个月)时分别为115、246、301、334、363、356、386和373个/μL。67.73%出现过各种可能与药物毒副作用相关的表现,主要有消化道症状、神经系统症状、肝功能损害、骨髓毒性、皮疹和血脂升高等,多发生于治疗启动12个月内;血脂分布异常和乳酸酸中毒较少见,多发生于启动2年以后;41例患者先后发生过Ⅲ/Ⅳ级毒副反应。因毒副反应而更换为其他一线药物者占19.22%,因病毒耐药或毒副反应而更换为二线药物者占11.67%。结论通过对HIV/AIDS患者HAART3~7年的多中心前瞻性观察,明确我国2个NRTI加1个NNRTI的HAART一线方案对大多数HIV/AIDS患者长期有效,病毒持续抑制,CD4+细胞增加;主要的毒副反应和死亡多发生在启动治疗12个月内。大多数HIV/AIDS患者可长期坚持一线药物治疗,少数因药物毒副反应或病毒耐药须换为二线药物治疗。 展开更多
关键词 艾滋病 高效抗逆转录病毒治疗 不良反应 临床观察 长期治疗
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高效抗逆转录病毒治疗间断过程中中药对CD4+T淋巴细胞和病毒载量的影响 被引量:11
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作者 赵红心 张福杰 +5 位作者 韩宁 兰孟东 姚均 刘志英 卢联合 魏红山 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期658-661,共4页
目的评估中药在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)间断过程中对CD4+T淋巴细胞和病毒载量的影响。方法采用齐多夫定/拉米夫定+依非韦伦方案,对19例HIV/AIDS患者进行HAART治疗,治疗6个月后停用HAART,换服中药2个月,而后再次启动HAART3个月,再... 目的评估中药在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)间断过程中对CD4+T淋巴细胞和病毒载量的影响。方法采用齐多夫定/拉米夫定+依非韦伦方案,对19例HIV/AIDS患者进行HAART治疗,治疗6个月后停用HAART,换服中药2个月,而后再次启动HAART3个月,再次停用并服中药3个月,观察患者体内CD4+T淋巴细胞和病毒载量的变化情况。结果在第1次治疗间断过程中,换用中药1个月时有43.8%的患者未出现病毒反弹,62.6%的患者免疫功能稳定或上升;2个月时有18.8%的患者未出现病毒反弹,43.8%的患者免疫功能稳定或上升;两者的病毒载量变化差异无显著性(P=0.097),换用中药2个月时的CD4+T淋巴细胞计数较1个月时显著下降(P=0.043)。在第2次治疗间断过程中,换用中药1个月时有33.3%的患者未出现病毒反弹,64.3%的患者免疫功能稳定或上升;3个月时有13.3%的患者为出现病毒反弹,46.6%的患者免疫功能稳定或上升;两者的病毒载量变化差异有显著性(P=0.017)。治疗12个月时,患者体内的CD4+T细胞计数显著高于基线水平(P=0.014)。结论中药可在一定程度上抑制HAART间断时的病毒反弹,维持患者的免疫功能,该作用可随间断时间的延长而减弱。 展开更多
关键词 高效抗逆转录病毒治疗 间断治疗 中药 CD4+T细胞 病毒载量
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携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究 被引量:15
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作者 陈香梅 徐开林 +3 位作者 潘秀英 李振宇 鹿群先 李德鹏 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2005年第4期641-644,共4页
为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN... 为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白基因 T细胞 基因转移
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Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定 被引量:19
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作者 何飞 谭颖徽 杨峥嵘 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1197-1200,共4页
目的 构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法 利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +... 目的 构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法 利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果 酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论 逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。 展开更多
关键词 Delta GFP IRES 逆转录病毒 基因转移 基因表达
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人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达 被引量:7
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作者 陈永井 施勤 +5 位作者 葛彦 徐宽枫 古涛 孙建军 李文香 张学光 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第2期110-114,共5页
目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93... 目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 PD-L1 基因克隆 逆转录病毒载体 构建 稳定表达
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含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立 被引量:13
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作者 陈道桢 李淑锋 +7 位作者 鲁晓萱 王静 苏宁 刘璐 黄鹰 童冠圣 洪泽辉 张丽珊 《医学研究生学报》 CAS 2003年第1期1-3,共3页
目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。 方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因... 目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。 方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。 结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。 结论 展开更多
关键词 HSVtk 基因重组 逆转录病毒 包装细胞 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达 被引量:9
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作者 傅建新 王玮 +2 位作者 卢大儒 岑建农 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期261-265,共5页
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交... 逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 基因表达 构建
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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 被引量:9
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作者 李炯 刘艳红 +4 位作者 安芳兰 刘俊林 刘湘涛 尚佑军 殷宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期376-382,共7页
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病... 为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 口蹄疫病毒 衣壳前体基因 绿色荧光蛋白基因 BHK-21细胞
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白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究 被引量:8
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作者 王琳 陆荫英 +3 位作者 成军 于敏 李克 刘妍 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第8期699-701,共3页
研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病... 研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病毒载体pLXSN IL 18,转染PA317细胞 ,以逆转录巢式RT PCR方法 ,验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL 18的表达 ,将假病毒颗粒感染 2 .2 .15细胞 ,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBVDNA。成功克隆出 5 80bp的小鼠IL 18全基因并构建逆转录病毒载体 ,在转染PA317细胞的上清中检测出含IL 18假病毒颗粒 ,上清感染 2 .2 .15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到14天时HBsAg已变为阴性 ,对HBVDNA有明显抑制作用。IL 18能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 白细胞介素18 逆转录病毒载体 基因治疗 乙型肝炎病毒感染 逆转录聚合酶链反应
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含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建 被引量:10
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作者 崔龙 曹广文 +6 位作者 王元和 屠岳 孟荣贵 高军 仇小芳 吴宗娣 谢苏庆 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期289-291,共3页
含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙,曹广文,王元和,屠岳,孟荣贵,高军,仇小芳,吴宗娣,谢苏庆关键词大肠癌;胞嘧啶脱氨酶基因;逆转录病毒载体;癌胚抗原;转录调控序列胞嘧啶脱氨酶(CD)是真菌及某些大肠... 含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙,曹广文,王元和,屠岳,孟荣贵,高军,仇小芳,吴宗娣,谢苏庆关键词大肠癌;胞嘧啶脱氨酶基因;逆转录病毒载体;癌胚抗原;转录调控序列胞嘧啶脱氨酶(CD)是真菌及某些大肠杆菌等DNA嘧啶补救合成途径中的关... 展开更多
关键词 大肠肿瘤 CD基因 逆转录病毒载体 病毒载体
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逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系 被引量:7
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作者 樊爱琳 王执民 +6 位作者 刘国鹏 郭卫平 张洪新 王义清 曹伟 李文献 倪代会 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期555-558,共4页
目的 :建立高效、稳定的大鼠 CRBH- 7919多药耐药细胞系。 方法 :利用逆转录病毒转染法将带有 mdr1c DNA全序列的逆转录病毒载体 p Ha MDR转入到大鼠 CRBH- 7919细胞中 ,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率 ;免疫组化检测细胞... 目的 :建立高效、稳定的大鼠 CRBH- 7919多药耐药细胞系。 方法 :利用逆转录病毒转染法将带有 mdr1c DNA全序列的逆转录病毒载体 p Ha MDR转入到大鼠 CRBH- 7919细胞中 ,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率 ;免疫组化检测细胞的 P-糖蛋白 (P- GP)表达 ,RT- PCR检测细胞内 mdr1m RNA的表达量 ,PCR检测 mdr1基因转移到细胞内的基因片段。 结果 :转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和 7.9倍 ,免疫组化见转基因细胞系 P- GP表达增加 ,RT- PCR示细胞内 mdr1m RNA的表达量增加 ,PCR表明转基因细胞内扩增出 m dr1片段。结论 :利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠 CRBH - 7919多药耐药细胞系 ,该细胞系具有耐药强度高。 展开更多
关键词 肿瘤化疗 动物模型 CRBH-7919多药耐药细胞系 大鼠 逆转录病毒转法
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