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水牛BTG2基因序列分析、过表达载体构建及组织表达研究
1
作者 徐媛媛 谢莹雪 +2 位作者 陆杏蓉 冯超 尚江华 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第9期4009-4020,共12页
【目的】克隆水牛B细胞易位基因2(B-cell translocation gene 2,BTG2)基因编码区,分析其编码蛋白的生物学特性,构建过表达载体并转染水牛卵巢颗粒细胞,探究该基因在水牛不同组织中的表达模式,为后续深入研究水牛BTG2基因的生物学功能奠... 【目的】克隆水牛B细胞易位基因2(B-cell translocation gene 2,BTG2)基因编码区,分析其编码蛋白的生物学特性,构建过表达载体并转染水牛卵巢颗粒细胞,探究该基因在水牛不同组织中的表达模式,为后续深入研究水牛BTG2基因的生物学功能奠定基础。【方法】采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、瘤胃、子宫角、乳腺和卵巢组织,提取总RNA后反转录获得cDNA。以水牛卵巢cDNA为模板克隆水牛BTG2基因编码区并测序,对水牛及不同物种的BTG2基因进行序列比对和系统进化树构建,利用在线软件预测水牛BTG2蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构等。构建OE-BTG2过表达载体并转染水牛颗粒细胞,检测转染后BTG2基因的表达情况。通过实时荧光定量PCR检测BTG2基因在水牛不同组织中的表达情况。【结果】水牛BTG2基因CDS区序列全长453 bp,共编码150个氨基酸。相似性比对结果显示,水牛与牦牛、普通牛、山羊和绵羊的核苷酸序列相似性均>98%,其中与牦牛和普通牛的相似性最高,达99.8%。系统进化树显示,水牛与牦牛和普通牛的遗传距离最近,与家鼠的遗传距离最远。水牛BTG2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,氨基酸序列的第1―108位有1个btg1结构域,共有15个磷酸化位点和1个O-糖基化位点,主要定位于细胞核中。BTG2蛋白主要与CNOT7、CNOT8、CNOT11、CNOT9、CNOT1、CNOT10、ATF3、ANKRD49、HES6和PRMT1等蛋白互作。水牛BTG2蛋白二级结构以α-螺旋、延伸链和无规则卷曲为主,三级结构预测结果与其一致。成功构建OE-BTG2过表达载体并转染至水牛颗粒细胞,与对照组(pcDNA3.1(+))相比,过表达组(OE-BTG2)细胞中BTG2基因表达量极显著升高(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,BTG2基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、瘤胃、子宫角、乳腺和卵巢组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】BTG2基因在不同物种中具有较高的保守性,且在水牛不同组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最高。试验结果为深入研究水牛BTG2基因的功能提供了参考依据。 展开更多
关键词 水牛 BTG2基因 生物信息学 过表达载体 组织表达
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龙胜凤鸡IGF2BP1基因的克隆、序列分析和过表达载体构建 被引量：1
2
作者 李现超 杨祝良 +5 位作者 孙甜甜 杨雪琴 张佳仪 黄超 粟永春 杨秀荣 《中国家禽》 北大核心 2024年第2期119-124,共6页
为研究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(Insulin-like growth factor 2 mRNAbinding protein 1,IGF2BP1)基因的序列和在鸡肌肉发育中的功能,研究克隆IGF2BP1基因并进行生物信息学分析,构建IGF2BP1的过表达载体pEGFP-IGF2BP1,在成肌细... 为研究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(Insulin-like growth factor 2 mRNAbinding protein 1,IGF2BP1)基因的序列和在鸡肌肉发育中的功能,研究克隆IGF2BP1基因并进行生物信息学分析,构建IGF2BP1的过表达载体pEGFP-IGF2BP1,在成肌细胞验证载体的功能。结果显示:龙胜凤鸡IGF2BP1基因CDS区序列全长1 731 bp,编码576个氨基酸,与参考序列相比,存在6处同义突变;物种间同源性分析显示,龙胜凤鸡IGF2BP1基因与原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、猪(Sus scrofa)、奶牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)的相似性分别为99.7%、94.7%、92.5%、82.4%、82.8%、82.7%;蛋白质二级、三级结构主要含有无规卷曲(45.83%)、α螺旋(27.26%)和延伸链(20.83%);经过酶切和测序鉴定显示,成功构建了pEGFP-IGF2BP1质粒,并且该质粒可在成肌细胞中表达绿色荧光,qRT-PCR结果显示IGF2BP1在试验组(转染pEGFP-IGF2BP1)的表达量极显著高于对照组(转染pEGFP-N1)(P<0.01)。结果表明,成功克隆IGF2BP1基因,构建的IGF2BP1基因过表达载体在成肌细胞中成功表达。 展开更多
关键词 龙胜凤鸡 IGF2BP1基因 生物信息学 过表达载体
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水稻OsAPX基因的克隆及过表达载体的构建 被引量：1
3
作者 许惠滨 连玲 +4 位作者 魏毅东 朱永生 谢华安 王宗华 张建福 《福建农业学报》 CAS 2013年第2期101-106,共6页
通过RT-PCR法从粳稻日本晴中克隆到ascorbate peroxidase(APX)基因,该基因的cDNA长为768bp,包含完整的CDS序列。将克隆到的片段连接到植物表达载体pBI121的相应位置,构建1个APX基因的过表达载体pBI121-APX。利用农杆菌EHA105介导该植物... 通过RT-PCR法从粳稻日本晴中克隆到ascorbate peroxidase(APX)基因,该基因的cDNA长为768bp,包含完整的CDS序列。将克隆到的片段连接到植物表达载体pBI121的相应位置,构建1个APX基因的过表达载体pBI121-APX。利用农杆菌EHA105介导该植物表达载体在籼稻"多系1号"和"航1号"中的遗传转化,以期成功获得转基因植株,为后期研究APX基因在水稻耐储藏方面所发挥的功能打下基础。 展开更多
关键词 克隆 APX 过表达载体 遗传转化
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Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究 被引量：1
4
作者 孙杰 涂敏 +2 位作者 卫积书 高文涛 苗毅 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期732-737,共6页
目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ... 目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体、pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力。结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P<0.05)。结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 Vasohibin-2 慢病毒过表达载体 细胞增殖
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水稻DREB1基因过表达载体的构建与转化 被引量：3
5
作者 刘喜平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第9期5-8,12,共5页
为了研究DREB1的功能,从水稻cDNA中克隆了DREB1基因,成功构建了该基因的高效植物表达载体pCAMBIA-DREB1。采用农杆菌介导法转化水稻,经PCR、Southern blot分析表明,DREB1基因已经成功地整合到水稻基因组中,获得水稻DREB1基因过表达转基... 为了研究DREB1的功能,从水稻cDNA中克隆了DREB1基因,成功构建了该基因的高效植物表达载体pCAMBIA-DREB1。采用农杆菌介导法转化水稻,经PCR、Southern blot分析表明,DREB1基因已经成功地整合到水稻基因组中,获得水稻DREB1基因过表达转基因植株。 展开更多
关键词 DREB1基因 转录因子 水稻 过表达载体
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野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建
6
作者 王银磊 陈伟男 +4 位作者 赵丽萍 周蓉 宋刘霞 余文贵 赵统敏 《中国蔬菜》 北大核心 2017年第12期30-34,共5页
根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中... 根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。 展开更多
关键词 番茄 根结线虫 Mi-9基因 同源克隆 过表达载体构建
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鸡Rbbp5基因的生物信息学分析及过表达载体构建
7
作者 王生存 张晨 +4 位作者 左其生 邹艺琛 赵娟娟 张亚妮 李碧春 《中国家禽》 北大核心 2021年第7期112-116,共5页
研究旨在利用生物信息学技术分析Rbbp5基因的生物学特征,构建过表达载体,为研究其在鸡生殖干细胞中的调控模式提供试验材料,以探讨其作为组蛋白甲基化修饰酶发挥作用的具体机制。试验利用多种在线工具分析RBBP5的氨基酸序列、保守结构... 研究旨在利用生物信息学技术分析Rbbp5基因的生物学特征,构建过表达载体,为研究其在鸡生殖干细胞中的调控模式提供试验材料,以探讨其作为组蛋白甲基化修饰酶发挥作用的具体机制。试验利用多种在线工具分析RBBP5的氨基酸序列、保守结构域、亲疏水性、跨膜结构域和信号肽表达,预测其二级、三级结构,进行互作蛋白的预测;采用双酶切和测序鉴定重组载体pcDNA3.1-Rbbp5-Gst;qRT-PCR验证重组载体在PGCs中的表达。结果显示:RBBP5蛋白含有高度保守的结构域——WD40,内含7段典型的WD40重复序列,其亲水性高、不含跨膜结构域、无信号肽表达,可用以构建过表达载体;同源建模和互作蛋白预测显示RBBP5高度保守,互作蛋白为ASH2L、WDR5、DPY30和MLL2等;双酶切和测序结果表明,Rbbp5成功插入pcDNA3.1载体,未出现移码和突变;qRT-PCR结果显示PGCs中重组载体可使Rbbp5过量表达。结果为探明Rbbp5在鸡原始生殖细胞形成中的功能和机制研究提供了试验素材和理论依据。 展开更多
关键词 Rbbp5 鸡 过表达载体 原始生殖干细胞
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绒山羊Hoxc13基因过表达载体的构建
8
作者 张燕军 吴江鸿 +1 位作者 张文广 李金泉 《中国草食动物科学》 CAS 2012年第S1期197-199,共3页
Hoxc13基因在毛囊形成、毛发生长、毛囊正常形态维持过程中扮演着一个重要角色。为了研究绒山羊Hoxc13的功能,根据GenBank中Hoxc13基因序列设计引物,采用重叠延伸PCR技术,分离并克隆了内蒙古绒山羊Hoxc13基因的cDNA序列,成功构建了该基... Hoxc13基因在毛囊形成、毛发生长、毛囊正常形态维持过程中扮演着一个重要角色。为了研究绒山羊Hoxc13的功能,根据GenBank中Hoxc13基因序列设计引物,采用重叠延伸PCR技术,分离并克隆了内蒙古绒山羊Hoxc13基因的cDNA序列,成功构建了该基因的过表达载体pECFP-Hoxc13。 展开更多
关键词 绒山羊 Hoxc13 过表达载体
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AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化
9
作者 刘博宇 阮颖 《作物研究》 2012年第3期205-208,223,共5页
AtCS25基因是拟南芥中一个功能未知的基因。生物信息学分析发现,该基因可能与花粉和花粉管的发育有关。为了进一步探究该基因的功能,克隆了AtCS25基因的全长CDS序列,并将克隆得到的片段插入到过表达载体pBI121相应的位置,构建了AtCS25... AtCS25基因是拟南芥中一个功能未知的基因。生物信息学分析发现,该基因可能与花粉和花粉管的发育有关。为了进一步探究该基因的功能,克隆了AtCS25基因的全长CDS序列,并将克隆得到的片段插入到过表达载体pBI121相应的位置,构建了AtCS25基因的过表达载体pBI121-AtCS25。通过农杆菌GV3101介导将该载体转入拟南芥Col生态型中,获得了5株转基因植株,为进一步研究AtCS25基因的功能奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 AtCS25 生物信息学分析 过表达载体构建 遗传转化
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拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化 被引量：5
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作者 张芸 李会 +3 位作者 车丽玲 黄思齐 邱承祥 杨志敏 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期25-29,共5页
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶... MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。 展开更多
关键词 miR395d前体 ATP硫酸化酶 硫转运体SULTR2 1 过表达载体 转基因
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甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建 被引量：5
11
作者 张超 付三雄 +4 位作者 周小婴 唐容 黄莎 杨克相 戚存扣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1399-1407,共9页
【目的】克隆甘蓝型油菜的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)基因(BnGPDH),分析其表达特性并构建植物过表达载体,为研究该基因在油菜种子三酰甘油(TAG)合成和积累中的作用机制提供理论参考。【方法】以甘蓝型油菜H105为材料,采用同源克隆技术克隆... 【目的】克隆甘蓝型油菜的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)基因(BnGPDH),分析其表达特性并构建植物过表达载体,为研究该基因在油菜种子三酰甘油(TAG)合成和积累中的作用机制提供理论参考。【方法】以甘蓝型油菜H105为材料,采用同源克隆技术克隆与At3G07690同源的BnGPDH基因,对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BnGPDH基因在甘蓝型油菜不同组织[根、茎、叶、蕾、花及花后(DAF)7、14、21、30和40 d角果皮和种子]及高、低油含量自交系角果皮和种子中的表达情况,并将克隆获得的BnGPDH基因连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上构建植物过表达载体。【结果】克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因编码区(CDS)长度均为1338 bp,编码445个氨基酸,其编码蛋白仅有5个氨基酸差异,均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_Gly3P_dh_C结构域,定位于细胞质,分别与白菜细胞质型GPDH蛋白(XP_009147040.1)和甘蓝细胞质型GPDH蛋白(XP_013585317.1)的氨基酸序列具有较高相似度,对应的相似度为100.00%和99.78%,且二者与双子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较近,与单子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较远。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同组织中均有表达,且表达模式总体上相似,在21DAF和30DAF种子中的表达量显著高于其他组织部位(P<0.05,下同),表明21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期,但在角果生长发育不同时期这2个基因的表达略有不同,且在茎、蕾、种子(7DAF、21DAF、30DAF和40DAF)和角果皮(7DAF和40DAF)中,BnGPDHc2-1基因的表达量均显著高于BnGPDHc2-2基因,而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达量显著高于BnGPDHc2-1基因。21DAF种子中BnGPDHc2-1基因在3个高油含量自交系中的表达量显著高于3个低油含量自交系,BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表达量显著高于3个低油含量自交系;在30DAF种子中,BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在3个高油含量自交系中的表达量均显著高于3个低油含量自交系。将BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因分别连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上可成功构建获得植物过表达载体。【结论】BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同发育期角果中行使的功能存在一定分化,在进化过程中可能分别来源于白菜基因组和甘蓝基因组,但均在甘蓝型油菜种子TAG合成和积累发挥重要调控作用。因此,构建的植物过表达载体可用于BnGPDH基因功能分析及油菜种子油含量基因工程改良研究。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH) 表达特性 生物信息学 植物过表达载体
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环状RNAhsa＿circ＿0082626的特征分析及过表达载体构建 被引量：3
12
作者 潘劲辉 姚文霞 +4 位作者 林海 牛秋玲 罗远卫 梁敏 周新科 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2019年第5期495-500,共6页
目的环状RNA是目前非编码RNA的研究热点,文章旨在研究由抗病毒基因ZC3HAV1基因转录而来的环状RNA hsa_circ_0082626的基本特征以及过表达载体的表达效果。方法利用反向剪切位点的验证、RNA酶消化试验和提取细胞质、细胞核RNA进行细胞内... 目的环状RNA是目前非编码RNA的研究热点,文章旨在研究由抗病毒基因ZC3HAV1基因转录而来的环状RNA hsa_circ_0082626的基本特征以及过表达载体的表达效果。方法利用反向剪切位点的验证、RNA酶消化试验和提取细胞质、细胞核RNA进行细胞内分布定位研究了hsa_circ_0082626的基本特征,RNA酶消化试验中将样品分为RNase R处理组与对照组,RNase R处理组加入20 U(2 U/μg)的RNase R,对照组用等量ddH2O替代,以此检测经RNA酶处理后的表达量变化。转染24、48和72 h后分别收集以转染重组质粒的细胞为过表达组、未经转染的细胞作为阴性对照组,RT-qPCR检测环状RNA表达效果。结果与对照组比较,RNase R处理组ZC3HAV1、GAPDH表达均降低(0.144±0.002 vs 1.000±0.016,0.772±0.058 vs 1.000±0.122,0.077±0.009 vs 1.000±0.164,P<0.05)。hsa_circ_0082626可以抵抗RNase R的处理,主要分布于细胞质。过表达组的hsa_circ_0082626表达量明显较阴性对照组明显增高,而且在转染48 h时的表达量最高(表达量约为对照组的1000倍)。结论成功分析了hsa_circ_0082626的反向剪切位点、RNA酶的抵抗性和在细胞中的表达定位等特征,证明了hsa_circ_0082626确实具有环状结构及成功构建了hsa_circ_0082626的过表达载体,为深入研究环状RNA hsa_circ_0082626的生物功能和机制提供了实验基础。 展开更多
关键词 ZC3HAV1 环状RNA RNA酶抵抗性 过表达载体
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小鼠NR1D1基因过表达载体的构建及其生物信息学分析 被引量：2
13
作者 董浩 江海圳 +3 位作者 李超 高登科 靳亚平 陈华涛 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期94-103,共10页
目的:构建小鼠核受体亚家族1组D成员1(NR1D1)基因的过表达载体,分析小鼠NR1D1蛋白的基本特征。方法:从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录后获得cDNA,采用PCR技术扩增得到小鼠NR1D1基因的编码区片段,经同源重组与pcDNA3.1载体相连接,将酶... 目的:构建小鼠核受体亚家族1组D成员1(NR1D1)基因的过表达载体,分析小鼠NR1D1蛋白的基本特征。方法:从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录后获得cDNA,采用PCR技术扩增得到小鼠NR1D1基因的编码区片段,经同源重组与pcDNA3.1载体相连接,将酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-NR1D1。将pcDNA3.1空质粒和pcDNA3.1-NR1D1重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为对照组和pcDNA3.1-NR1D1转染组,48 h后提取总RNA和总蛋白样品,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Westernblotting法检测2组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平。使用DNAStar和MEGA7软件对小鼠与其他物种的NR1D1基因编码区序列(CDS)进行相似性分析,并构建系统进化树;利用ExPASy、ProtScale、SingalP5.0、TMHMM-2.0、PhosphoSitePlus®、SOPMA和SWISS-MODEL等在线工具分析NR1D1蛋白的氨基酸组成、亲/疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构。结果:酶切鉴定和测序结果均表明过表达载体pcDNA3.1-NR1D1构建成功。与对照组比较,pcDNA3.1-NR1D1转染组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。生物信息学分析,小鼠NR1D1 CDS区与人、大鼠、中国仓鼠、黑猩猩、兔、犬、猪、马、牛、绵羊、山羊、家猫和斑马鱼的相似性分别为90.0%、94.8%、86.5%、90.0%、89.6%、88.3%、89.7%、89.8%、88.8%、89.1%、89.1%、89.7%和65.1%。系统进化树分析,小鼠NR1D1基因与中国仓鼠和大鼠的遗传距离最近,与斑马鱼的遗传距离最远。小鼠NR1D1蛋白是一种疏水性碱性蛋白质,不属于分泌蛋白和跨膜蛋白,含有12个磷酸化位点和10个泛素化位点;二级结构中无规则卷曲占54.63%,α-螺旋占26.50%,延伸链占12.68%,β-转角占6.18%;三级结构预测,小鼠与人的NR1D1蛋白相似度大,差异较小。结论:成功构建了小鼠NR1D1基因过表达载体pcDNA3.1-NR1D1,验证了其在HEK293T细胞中的过表达效果,为进一步研究NR1D1基因及其蛋白的功能提供了依据。 展开更多
关键词 小鼠 ICR 核受体亚家族1组D成员1 生物钟 过表达载体 生物信息学
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绵羊CTSB基因过表达载体的构建及生物信息学分析 被引量：1
14
作者 韩红叶 张丽萌 +5 位作者 刘爱菊 马晓菲 李悦欣 高旭 王志刚 田树军 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期93-96,116,共5页
为了构建组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)基因的真核表达载体,进一步研究其蛋白的结构和功能,本试验以绵羊卵巢组织的cDNA为模板,扩增绵羊卵巢CTSB基因的CDS编码区,将其插入真核表达载体中成功获得重组质粒pcDNA3.1-CTSB,利用生物学信息... 为了构建组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)基因的真核表达载体,进一步研究其蛋白的结构和功能,本试验以绵羊卵巢组织的cDNA为模板,扩增绵羊卵巢CTSB基因的CDS编码区,将其插入真核表达载体中成功获得重组质粒pcDNA3.1-CTSB,利用生物学信息学分析软件对绵羊卵巢CTSB基因的结构和功能进行分析鉴定。研究结果表明:成功构建了重组质粒pcDNA3.1-CTSB,发现CTSB基因主要在细胞外行使功能,CTSB蛋白具有翻译后磷酸化及糖基化修饰特性,CTSB与LGMN、NLRP3、CTSD蛋白之间存在一定互作关系,上述发现将为进一步探究绵羊CTSB基因的功能提供重要线索。 展开更多
关键词 绵羊 CTSB 过表达载体 蛋白结构 蛋白功能
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山羊CREBZF蛋白两种亚型过表达载体的构建及其对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响 被引量：2
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作者 牛宏宇 张瑞雪 +4 位作者 齐茂振 马玉洁 曲栓 靳亚平 林鹏飞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期132-140,共9页
旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型(长亚型SMILE和短亚型Zhangfei)基因的过表达载体,并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)凋亡的影响。本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物,分段进行PCR扩增;运用无缝... 旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型(长亚型SMILE和短亚型Zhangfei)基因的过表达载体,并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)凋亡的影响。本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物,分段进行PCR扩增;运用无缝克隆技术将所获得各目的基因片段与线性化pcDNA3.1(+)载体连接,构建pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei重组过表达载体,通过双酶切和测序进行鉴定;转染过表达载体至gEECs,提取总RNA和蛋白,通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效率;应用流式细胞术检测过表达SMILE和Zhangfei对gEECs凋亡率的影响。PCR、双酶切显示各目的条带大小正确;测序显示目的片段与NCBI基因库中山羊CREBZF的预测序列一致性为100%;转染过表达载体后,gEECs中SMILE与Zhangfei在转录和翻译水平的表达量均显著增加,并发现SMILE可能在翻译后自身被修饰;空载体组细胞凋亡率为8.45%;转染pcDNA3.1(+)-SMILE组凋亡率显著上升至12.41%(P<0.01);转染pcDNA3.1(+)-Zhangfei组凋亡率上升至9.83%,但相较于空载体组统计学差异不显著;结果提示,CREBZF可能调控gEECs的凋亡进程。本研究将目的基因分段克隆与无缝克隆技术联用,构建了上述2种过表达载体,为进一步探究CREBZF在反刍动物子宫内膜上皮细胞周期性变化中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 CREBZF 过表达载体 无缝克隆 山羊子宫内膜上皮细胞 凋亡
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拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建 被引量：2
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作者 韦春 杨莉琴 秦利军 《种子》 北大核心 2021年第1期1-5,10,共6页
BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能。DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克... BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能。DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542 bp的特异性条带,测序结果表明该条带为AtDWF4基因;生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscale在线预测该蛋白为亲水性蛋白,且SOPM分析表明DWF 4蛋白含有α-螺旋(alpha-helix)、β-折叠(beta-fold)、β-转角(beta-angle)等多个二级结构。同时,研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI 201-RdDwf 4,并遗传转化烟草K 326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。本研究为进一步探究过表达AtDWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。 展开更多
关键词 拟南芥 BRs DWF4基因 过表达载体构建
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Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化
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作者 吴倩倩 胡敏伦 +5 位作者 钟云 闫化学 姜波 吴波 钟广炎 高峰 《华南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第4期68-73,共6页
文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘(Citus reticulate)的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR.通... 文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘(Citus reticulate)的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR.通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株.这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持. 展开更多
关键词 Mi基因 16D10基因 过表达载体 RNAI载体 根结线虫
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红麻线粒体基因atp6过表达载体的构建与转化
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作者 韦美玲 廖小芳 +6 位作者 李枝玲 周步进 郑杰 孔祥军 刘一丁 李宏伟 周瑞阳 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第12期2740-2746,共7页
【目的】构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,为红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究打下基础。【方法】以红麻UG93A花药cDNA为模板,通过同源克隆技术克隆atp6基因编码区(CDS)的全长序列;利用In-Fusion基因融合技术构建植物... 【目的】构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,为红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究打下基础。【方法】以红麻UG93A花药cDNA为模板,通过同源克隆技术克隆atp6基因编码区(CDS)的全长序列;利用In-Fusion基因融合技术构建植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草,并对转基因阳性烟草植株进行抗性筛选和PCR验证。【结果】红麻UG93A的atp6基因CDS全长为1182 bp,成功构建红麻atp6基因全长过表达载体pBI121-atp6-EGFP,并获得4株转基因烟草植株(B1、B2、B3和B4),使用过表达载体上3对不同位点的引物组合对转基因植株进行PCR验证,发现有2株转基因烟草植株在3对不同引物中稳定表达,即获得2株含pBI121-atp6-EGFP的T0代转基因阳性植株(B1和B2)。【结论】构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,可用于指导后续atp6基因调控红麻细胞质雄性不育(CMS)分子机理研究。 展开更多
关键词 红麻 细胞质雄性不育(CMS) atp6基因 过表达载体 转化
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抗性候选基因GmMIOX4的表达分析、克隆及过表达载体的构建
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作者 刘婷 杨若巍 +3 位作者 王学敏 于佰双 王惠 段玉玺 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期730-735,共6页
将两个不同抗性大豆品种灰皮支黑豆和辽豆15人工接种大豆胞囊线虫3号生理小种(SCN3),利用实时荧光定量PCR技术,对SCN3侵染后的早期和线虫完成一个整个生活史时的Gm MIOX4基因相对表达量变化进行分析。结果表明:在SCN3侵染下,辽豆15根内... 将两个不同抗性大豆品种灰皮支黑豆和辽豆15人工接种大豆胞囊线虫3号生理小种(SCN3),利用实时荧光定量PCR技术,对SCN3侵染后的早期和线虫完成一个整个生活史时的Gm MIOX4基因相对表达量变化进行分析。结果表明:在SCN3侵染下,辽豆15根内的Gm MIOX4基因在25 dpi时,相对表达量升高,而灰皮支黑豆根内的Gm MIOX4基因在10 dpi时被诱导表达,相对表达量达到最高值,表明该基因在此时期发挥一定作用。线虫侵入大豆根内10 d是其通过合胞体吸取寄主营养从而维持正常生长发育的时期,在10 dpi该基因被诱导表达,使其合胞体结构发生改变,从而抑制线虫发育,最终导致死亡或使灰皮支黑豆根内成虫数量减少,起到抗病效果。随后以抗性品种灰皮支黑豆根系总RNA为模板,利用RT-PCR技术获得了939 bp的Gm MIOX4基因的CDS序列,克隆得到质粒p GEM-MIOX4,再以得到的Gm MIOX4序列为材料构建过表达载体p CAM-MIOX4,为进一步研究Gm MIOX4基因功能奠定了基础。 展开更多
关键词 GmMIOX4基因 大豆胞囊线虫 实时荧光定量PCR 克隆 过表达载体
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蛋鸭circ-ZNF326的特征分析、过表达载体的构建及对小肠上皮细胞增殖的影响
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作者 魏文焯 郑超 +5 位作者 吴艳 梁振华 皮劲松 杜金平 李成凤 张昊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期837-844,共8页
【目的】明确circ-ZNF326的基本特征及对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响。【方法】以绿头鸭为研究对象,采集鸭胚肠道并培养小肠上皮细胞,提取RNA并反转录为cDNA,参考circ-ZNF326的全长序列设计引物,通过PCR反应扩增获得circ-ZNF326的部分序... 【目的】明确circ-ZNF326的基本特征及对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响。【方法】以绿头鸭为研究对象,采集鸭胚肠道并培养小肠上皮细胞,提取RNA并反转录为cDNA,参考circ-ZNF326的全长序列设计引物,通过PCR反应扩增获得circ-ZNF326的部分序列,测序后利用反向剪接位点验证其成环方式。利用PARISTM Kit提取细胞核与细胞质RNA检测其在细胞中的核质分布情况。合成circ-ZNF326全长序列并利用双酶切及T4连接酶将circ-ZNF326全长序列连接在PLCDH-ciR真核表达载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞扩大培养,提取重组质粒进行双酶切及琼脂糖凝胶电泳检测,将circ-ZNF326过表达载体转染小肠上皮细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测circ-ZNF326过表达后的表达效率,利用CCK-8检测过表达circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响。【结果】circ-ZNF326是由ZNF326基因第10、11和12号外显子反向剪接而成,且主要分布在细胞质中。circ-ZNF326过表达载体构建成功,表达效率极显著高于空载组(P<0.01)。将circ-ZNF326过表达载体转染小肠上皮细胞,结果发现,circ-ZNF326过载组在24~72 h细胞活力极显著或显著高于空载组(P<0.01;P<0.05)。【结论】本试验成功验证了circ-ZNF326的反向剪接与环状结构,证明了circ-ZNF326主要富集在细胞质中,并构建了circ-ZNF326过表达载体,证实了过表达circ-ZNF326可提高蛋鸭小肠上皮细胞的活力,为深入研究circ-ZNF326的生物学功能及其对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的调控机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 环状RNA 蛋鸭 circ-ZNF326 核质分布 过表达载体
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