芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛...芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛选法(磁珠-SELEX)开展10轮筛选,经由高通量测序获得6条候补序列(S1~S6),并进行家族性、同源性分析及二级结构预测。结果表明,6条候选核酸适体的重复率可达46.38%,其自由能在-9.02到-2.47 kcal·moL^(-1)之间,根据自由能能量稳定原则,S1和S5吉布斯自由能最低最稳定,分别为-6.70和-9.02 kcal·moL^(-1)。利用ELISA试验进行亲和力测试,结果表明核酸适体S1和S2的亲和能力较强,S1:KD=67.02 nmol·L^(-1),R2=0.925 8,S2:KD=97.65 nmol·L^(-1),R2=0.795 1。核酸适体S1与过敏原Ses i 2的结合力和其他过敏原蛋白相比有显著差异,可视为具有特异性。本研究最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的核酸适体S1,为芝麻过敏原快速检测提供了技术支撑。展开更多
荞麦是一种常见的食物过敏原,能够引发呼吸系统、消化系统、循环系统等方面的疾病,严重时可导致过敏性休克甚至死亡。明确荞麦中的主要过敏蛋白,确定其中的过敏原表位,对荞麦致敏机理解析及预防治疗相关的过敏疾病具有重要意义。本文综...荞麦是一种常见的食物过敏原,能够引发呼吸系统、消化系统、循环系统等方面的疾病,严重时可导致过敏性休克甚至死亡。明确荞麦中的主要过敏蛋白,确定其中的过敏原表位,对荞麦致敏机理解析及预防治疗相关的过敏疾病具有重要意义。本文综述了荞麦中的主要过敏原(Fag e 1、Fag e 2、Fag e 3、Fag e 4、Fag e 5、Fag t 2、Fag t 3、Fag t 6)结构特征及其表位的研究进展,旨在为荞麦过敏深入研究与防治提供一定参考。展开更多
目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-F...目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-Fel d 1,随后表达并纯化Fel d 1重组蛋白;对BALB/c小鼠进行免疫,制备单克隆抗体。以重组Fel d 1作为包被蛋白建立间接ELISA方法,筛选杂交瘤细胞株;利用Western blot法验证单克隆抗体的特异性并鉴定其抗原表位。将筛选出的杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠腹腔,大量制备单克隆抗体。结果成功构建了重组质粒pET-28a-Fel d 1,对表达条件进行优化后获得了可溶性表达的Fel d 1蛋白。Western blot法及抗体效价测定结果显示,获得了2株稳定分泌抗Fel d 1特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7D11和5H4;抗体鉴定结果显示,5H4抗体亚型为IgG2a,可识别Fel d 1第105-163位氨基酸区域;7D11抗体亚型为IgG1,可识别Fel d 1第1-59位氨基酸区域。结论本研究获得的高纯度重组Fel d 1蛋白将为临床免疫治疗猫毛过敏提供一种备选方案;此外,制备的单克隆抗体将为深入研究Fel d 1的生物学功能及ELISA检测方法的研发奠定物质基础。展开更多
Ara h 2是花生主要过敏原之一,为开发食物中Ara h 2过敏原成分的快速检测方法,减少因误食导致花生过敏事件的发生,该研究采用鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度,建立了一种检测花生...Ara h 2是花生主要过敏原之一,为开发食物中Ara h 2过敏原成分的快速检测方法,减少因误食导致花生过敏事件的发生,该研究采用鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度,建立了一种检测花生过敏原Ara h 2的间接双抗夹心化学发光酶免疫分析法,并对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行评价。该方法的检出限为1.085 ng/mL,线性范围为3.12~200 ng/mL,添加回收率为78.30%~94.39%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好,与其他常见食物过敏原无交叉反应。该方法与相同抗体所建立的间接双抗夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法相比,在灵敏度上表现出一定优势。该研究开发的化学发光酶免疫分析法可对花生食品生产过程中和消费前的Ara h 2过敏原成分检测提供可靠的技术支持。展开更多
基于食品基质中松仁过敏原Pin k 2建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法。将松仁经过研磨、脱脂、浸提、酶解后经Easy-nLC 1000-QExactive高分辨质谱仪进行分离分析,结合Uniprot蛋白数据库以及ProteinPilotTM软件对质谱图进行数据处理,...基于食品基质中松仁过敏原Pin k 2建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法。将松仁经过研磨、脱脂、浸提、酶解后经Easy-nLC 1000-QExactive高分辨质谱仪进行分离分析,结合Uniprot蛋白数据库以及ProteinPilotTM软件对质谱图进行数据处理,经BLAST验证特异性,最终筛选3条松仁特异性肽段。方法学验证结果表明,方法在0.001~50mg/mL范围内线性关系良好,定量限为1mg/kg;在饼干、巧克力和饮料3种空白基质中的平均回收率为88.50%~107.57%,相对标准偏差不高于6.08%,基质效应为89.77%~96.13%。该方法具有灵敏度高、特异性好的优势,可应用于饼干、巧克力、饮料等食品样品中松仁过敏原的检测,为我国食品标签真实性检验及食品中隐性过敏原的检测提供技术支持。展开更多
【目的】鹰嘴桃是岭南地区的特色水果,因其良好的风味和品质被评为“岭南十大佳果”。通过分析鹰嘴桃过敏原蛋白的抗原表位,为过敏原重组抗原的制备提供研究基础,也为阐述食品加工过程中鹰嘴桃过敏原的特性变化和致敏特性提供研究依据...【目的】鹰嘴桃是岭南地区的特色水果,因其良好的风味和品质被评为“岭南十大佳果”。通过分析鹰嘴桃过敏原蛋白的抗原表位,为过敏原重组抗原的制备提供研究基础,也为阐述食品加工过程中鹰嘴桃过敏原的特性变化和致敏特性提供研究依据。【方法】利用磷酸缓冲液提取鹰嘴桃冻干粉中的粗蛋白,采用SDS-PAGE蛋白电泳方法鉴定并联合蛋白质谱方法分析粗蛋白中存在的过敏原,通过蛋白数据库UniProt进行筛选比对,并采用生物信息学方法分析致敏蛋白的理化性质、空间结构和抗原表位等生物学特性。【结果】从鹰嘴桃中鉴定出7种致敏蛋白(A0A251RBV3、P86888、M5X697、M5WV03、M5WTQ8、Q2I6V8、Q9LED1),主要归属于病程相关蛋白(Pru p 1)、类甜蛋白(Pru p 2)、非特异性脂质转移蛋白家族(Pru p 3)和赤霉素调节蛋白(Pru p 7)4类过敏原蛋白。7种鹰嘴桃过敏原蛋白具有较高稳定性,分子量为6.91~26.04 kD,脂肪族氨基酸指数为29.37~81.54。M5WTQ8和Q2I6V8过敏原蛋白为酸性蛋白,其余过敏原蛋白为碱性蛋白。除Q9LED1蛋白外,其余过敏原蛋白均为亲水蛋白。筛选抗原表位、亲水性和柔韧性大于0且表面可及性大于1的区域,并结合二、三级蛋白结构分析蛋白键能较低的区域,获得鹰嘴桃过敏原的抗原表位分别为Pru p 1(EIP、GSQ、KEN、NL、KG、EIK、HPD)、Pru p 2(TGDQKPQ、SP、NQ、PPNDKPETCPPT、DDKSS、RP)、Pru p 3(RT、VN)和Pru p 7(AGY、GTYGN、LKNSKGN)。【结论】通过对鹰嘴桃过敏原蛋白的结构、亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数进行分析,获得过敏原蛋白的多个抗原表位,可为鹰嘴桃过敏原在食品加工中的致敏特性研究提供研究基础。展开更多
基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产...基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。展开更多
文摘芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛选法(磁珠-SELEX)开展10轮筛选,经由高通量测序获得6条候补序列(S1~S6),并进行家族性、同源性分析及二级结构预测。结果表明,6条候选核酸适体的重复率可达46.38%,其自由能在-9.02到-2.47 kcal·moL^(-1)之间,根据自由能能量稳定原则,S1和S5吉布斯自由能最低最稳定,分别为-6.70和-9.02 kcal·moL^(-1)。利用ELISA试验进行亲和力测试,结果表明核酸适体S1和S2的亲和能力较强,S1:KD=67.02 nmol·L^(-1),R2=0.925 8,S2:KD=97.65 nmol·L^(-1),R2=0.795 1。核酸适体S1与过敏原Ses i 2的结合力和其他过敏原蛋白相比有显著差异,可视为具有特异性。本研究最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的核酸适体S1,为芝麻过敏原快速检测提供了技术支撑。
文摘荞麦是一种常见的食物过敏原,能够引发呼吸系统、消化系统、循环系统等方面的疾病,严重时可导致过敏性休克甚至死亡。明确荞麦中的主要过敏蛋白,确定其中的过敏原表位,对荞麦致敏机理解析及预防治疗相关的过敏疾病具有重要意义。本文综述了荞麦中的主要过敏原(Fag e 1、Fag e 2、Fag e 3、Fag e 4、Fag e 5、Fag t 2、Fag t 3、Fag t 6)结构特征及其表位的研究进展,旨在为荞麦过敏深入研究与防治提供一定参考。
文摘目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-Fel d 1,随后表达并纯化Fel d 1重组蛋白;对BALB/c小鼠进行免疫,制备单克隆抗体。以重组Fel d 1作为包被蛋白建立间接ELISA方法,筛选杂交瘤细胞株;利用Western blot法验证单克隆抗体的特异性并鉴定其抗原表位。将筛选出的杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠腹腔,大量制备单克隆抗体。结果成功构建了重组质粒pET-28a-Fel d 1,对表达条件进行优化后获得了可溶性表达的Fel d 1蛋白。Western blot法及抗体效价测定结果显示,获得了2株稳定分泌抗Fel d 1特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7D11和5H4;抗体鉴定结果显示,5H4抗体亚型为IgG2a,可识别Fel d 1第105-163位氨基酸区域;7D11抗体亚型为IgG1,可识别Fel d 1第1-59位氨基酸区域。结论本研究获得的高纯度重组Fel d 1蛋白将为临床免疫治疗猫毛过敏提供一种备选方案;此外,制备的单克隆抗体将为深入研究Fel d 1的生物学功能及ELISA检测方法的研发奠定物质基础。
文摘Ara h 2是花生主要过敏原之一,为开发食物中Ara h 2过敏原成分的快速检测方法,减少因误食导致花生过敏事件的发生,该研究采用鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度,建立了一种检测花生过敏原Ara h 2的间接双抗夹心化学发光酶免疫分析法,并对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行评价。该方法的检出限为1.085 ng/mL,线性范围为3.12~200 ng/mL,添加回收率为78.30%~94.39%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好,与其他常见食物过敏原无交叉反应。该方法与相同抗体所建立的间接双抗夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法相比,在灵敏度上表现出一定优势。该研究开发的化学发光酶免疫分析法可对花生食品生产过程中和消费前的Ara h 2过敏原成分检测提供可靠的技术支持。
文摘基于食品基质中松仁过敏原Pin k 2建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法。将松仁经过研磨、脱脂、浸提、酶解后经Easy-nLC 1000-QExactive高分辨质谱仪进行分离分析,结合Uniprot蛋白数据库以及ProteinPilotTM软件对质谱图进行数据处理,经BLAST验证特异性,最终筛选3条松仁特异性肽段。方法学验证结果表明,方法在0.001~50mg/mL范围内线性关系良好,定量限为1mg/kg;在饼干、巧克力和饮料3种空白基质中的平均回收率为88.50%~107.57%,相对标准偏差不高于6.08%,基质效应为89.77%~96.13%。该方法具有灵敏度高、特异性好的优势,可应用于饼干、巧克力、饮料等食品样品中松仁过敏原的检测,为我国食品标签真实性检验及食品中隐性过敏原的检测提供技术支持。
文摘【目的】鹰嘴桃是岭南地区的特色水果,因其良好的风味和品质被评为“岭南十大佳果”。通过分析鹰嘴桃过敏原蛋白的抗原表位,为过敏原重组抗原的制备提供研究基础,也为阐述食品加工过程中鹰嘴桃过敏原的特性变化和致敏特性提供研究依据。【方法】利用磷酸缓冲液提取鹰嘴桃冻干粉中的粗蛋白,采用SDS-PAGE蛋白电泳方法鉴定并联合蛋白质谱方法分析粗蛋白中存在的过敏原,通过蛋白数据库UniProt进行筛选比对,并采用生物信息学方法分析致敏蛋白的理化性质、空间结构和抗原表位等生物学特性。【结果】从鹰嘴桃中鉴定出7种致敏蛋白(A0A251RBV3、P86888、M5X697、M5WV03、M5WTQ8、Q2I6V8、Q9LED1),主要归属于病程相关蛋白(Pru p 1)、类甜蛋白(Pru p 2)、非特异性脂质转移蛋白家族(Pru p 3)和赤霉素调节蛋白(Pru p 7)4类过敏原蛋白。7种鹰嘴桃过敏原蛋白具有较高稳定性,分子量为6.91~26.04 kD,脂肪族氨基酸指数为29.37~81.54。M5WTQ8和Q2I6V8过敏原蛋白为酸性蛋白,其余过敏原蛋白为碱性蛋白。除Q9LED1蛋白外,其余过敏原蛋白均为亲水蛋白。筛选抗原表位、亲水性和柔韧性大于0且表面可及性大于1的区域,并结合二、三级蛋白结构分析蛋白键能较低的区域,获得鹰嘴桃过敏原的抗原表位分别为Pru p 1(EIP、GSQ、KEN、NL、KG、EIK、HPD)、Pru p 2(TGDQKPQ、SP、NQ、PPNDKPETCPPT、DDKSS、RP)、Pru p 3(RT、VN)和Pru p 7(AGY、GTYGN、LKNSKGN)。【结论】通过对鹰嘴桃过敏原蛋白的结构、亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数进行分析,获得过敏原蛋白的多个抗原表位,可为鹰嘴桃过敏原在食品加工中的致敏特性研究提供研究基础。
文摘基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。
