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Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞
被引量：
5
1
作者
王海
黄博
+2 位作者
周跃
李长青
王建
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第10期965-968,共4页
目的通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能。方法从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育2...
目的通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能。方法从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育20 min后将未贴壁细胞及培养液转移至新培养瓶再孵育40 min,吸弃未贴壁细胞及培养液,所得2瓶细胞进行体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面标志物。对筛选后的细胞进行向多系细胞诱导分化。结果第2代细胞筛选前,细胞形态个体差异较大,呈三角形或多角形,融合时呈铺路石样外观,筛选后细胞形态比较均匀,形成细胞克隆群。流式细胞仪检测发现:经Fibronectin筛选后所获软骨终板干细胞CD90、CD73表达阳性率>95%,CD105表达阳性率>85%;经诱导能向骨、软骨及脂肪细胞方向分化。结论 Fibronectin筛选所得的软骨终板细胞基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义标准。Fibronectin差别黏附筛选法得够有效筛选、纯化软骨终板干细胞。
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关键词
纤维连接蛋白
软骨终板干细胞
差别黏附筛选法
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职称材料
人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究
被引量：
7
2
作者
常献
周跃
李长青
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第1期54-61,共8页
目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终...
目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P<0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P<0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P<0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。
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关键词
软骨终板干细胞
退变髓核
细胞
共培养
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职称材料
缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制
被引量：
5
3
作者
浦路桥
刘杰
+2 位作者
袁超
贾敏
王建
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第5期449-455,共7页
目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在...
目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用。方法 :从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,Western Blot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平。使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平。结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性。实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)%显著高于对照组的(14.87±2.03)%(P<0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18%(P<0.05)。与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P<0.05)。结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的。
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关键词
软骨终板干细胞
缺氧和营养缺乏
凋亡
B
细胞
淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)腺病毒E1B
19-kDa结合蛋白
Bcl-2关联x蛋白
Bcl-2关联k蛋白
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职称材料
题名
Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞
被引量：
5
1
作者
王海
黄博
周跃
李长青
王建
机构
第三军医大学新桥医院骨科
出处
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第10期965-968,共4页
基金
国家自然科学基金(81101364
81071498)~~
文摘
目的通过Fibronectin介导进行差别黏附筛选软骨终板干细胞,观察筛选的效果及其初步生物学性能。方法从脊柱融合术中获取椎间盘软骨终板标本,机械-酶消化法获取原代软骨终板细胞,体外扩增至第2代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶,孵育20 min后将未贴壁细胞及培养液转移至新培养瓶再孵育40 min,吸弃未贴壁细胞及培养液,所得2瓶细胞进行体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面标志物。对筛选后的细胞进行向多系细胞诱导分化。结果第2代细胞筛选前,细胞形态个体差异较大,呈三角形或多角形,融合时呈铺路石样外观,筛选后细胞形态比较均匀,形成细胞克隆群。流式细胞仪检测发现:经Fibronectin筛选后所获软骨终板干细胞CD90、CD73表达阳性率>95%,CD105表达阳性率>85%;经诱导能向骨、软骨及脂肪细胞方向分化。结论 Fibronectin筛选所得的软骨终板细胞基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义标准。Fibronectin差别黏附筛选法得够有效筛选、纯化软骨终板干细胞。
关键词
纤维连接蛋白
软骨终板干细胞
差别黏附筛选法
Keywords
fibronectin
cartilage endplate-derived stem cells
differential adhesion assay
分类号
R322.71 [医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]
R329-33 [医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]
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职称材料
题名
人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究
被引量：
7
2
作者
常献
周跃
李长青
机构
第三军医大学附属新桥医院骨科重庆市沙坪坝区新桥正街
出处
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第1期54-61,共8页
文摘
目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P<0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P<0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P<0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。
关键词
软骨终板干细胞
退变髓核
细胞
共培养
Keywords
Cartilage endplate stem cells
Degenerative nucleus pulposus cells
Co-colture
分类号
Q813.1 [生物学—生物工程]
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职称材料
题名
缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制
被引量：
5
3
作者
浦路桥
刘杰
袁超
贾敏
王建
机构
第三军医大学附属新桥医院骨科
出处
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第5期449-455,共7页
基金
国家自然科学基金资助项目(编号:81272028)
文摘
目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用。方法 :从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,Western Blot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平。使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平。结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性。实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)%显著高于对照组的(14.87±2.03)%(P<0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18%(P<0.05)。与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P<0.05)。结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的。
关键词
软骨终板干细胞
缺氧和营养缺乏
凋亡
B
细胞
淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)腺病毒E1B
19-kDa结合蛋白
Bcl-2关联x蛋白
Bcl-2关联k蛋白
Keywords
Cartilage endplate-derived stem cells
Hypoxia and nutrition deprivation
Apoptosis
BNIP3
Bax
Bak
分类号
R393 [医药卫生—基础医学]
R681.5 [医药卫生—骨科学]
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被引量
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Fibronectin差别黏附法筛选、纯化软骨终板干细胞
王海
黄博
周跃
李长青
王建
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
5
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职称材料
2
人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究
常献
周跃
李长青
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2015
7
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职称材料
3
缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制
浦路桥
刘杰
袁超
贾敏
王建
《中国脊柱脊髓杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017
5
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