为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I...为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。结果显示,所建立的4种细胞因子SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法熔解曲线呈单一峰,无引物二聚体;4种细胞因子重组质粒标准品最低检测限分别为IL-6:1.40×10^(2)拷贝/μL、IL-1β:1.92×10^(2)拷贝/μL、IFN-γ:1.69×10^(2)拷贝/μL、TNF-α:2.31×10^(1)拷贝/μL;组内及组间变异系数在0.1%~2.3%。表明所建立的山羊4种细胞因子荧光定量RT-PCR特异性强,灵敏度高,稳定性好,可用于4种细胞因子mRNA转录水平的检测。随后本研究将包含编码ORFV 129完整蛋白基因的重组质粒pEGFP-ORFV 129和pEGFP-N1空质粒分别转染山羊睾丸支持细胞(GTSCs)24 h后,用终浓度20 ng/mL的TNF-α刺激转染细胞6 h后收集细胞,利用建立的荧光定量RT-PCR方法检测GTSCs中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α共4种细胞因子mRNA的转录水平,结果显示,与转染pEGFP-N1空载的细胞相比,转染了pEGFP-ORFV 129重组质粒的细胞IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的转录水平均极显著下降(p<0.001),该细胞中TNF-α的mRNA转录水平也下降,但与对照组相比差异不显著(p>0.1),表明ORFV 129蛋白能够抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平。本研究通过建立山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量PCR方法,首次检测证实了ORFV 129蛋白不同程度地抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平,为ORFV129蛋白功能研究奠定了基础。展开更多
文摘目的研究柴胡皂苷A(saikosaponin A,SSA)对小鼠骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)M1/M2型巨噬细胞分化、凋亡和功能的影响,并探究其分子机制。方法体外诱导BMDM分别向M1/M2型巨噬细胞分化,并同时加入SSA处理后:CCK-8检测BMDM、M1/M2型巨噬细胞的活性;倒置荧光显微镜观察M1/M2型巨噬细胞形态;流式细胞术(flow cytometry,FCM)和ELISA法检测M1/M2型巨噬细胞表面标志物和细胞因子水平;实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)检测IL-6、TNF-α、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的mRNA水平;FCM检测腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球颗粒的能力;免疫组织荧光染色(immunofluorescence,IF)和Western blot检测SSA调控M1/M2型巨噬细胞的分子机制。结果SSA浓度在10.0 mg/L范围内对细胞活性无明显影响,SSA浓度15.0 mg/L时,M1/M2型巨噬细胞活性均受到明显抑制(P<0.01);10.0 mg/L SSA处理后的M1/M2型巨噬细胞形态发生变化,M1型巨噬细胞出现纺锤状或不规则形,少数细胞具有伪足,部分细胞边界不清;M2型巨噬细胞部分变为类圆形或者不规则形(P<0.001),边界不清楚。SSA处理后BMDM分化为M1/M2型巨噬细胞的比例均显著降低(P<0.05),且M1型巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α的水平和其mRNA水平均显著降低(P<0.05),但M2型巨噬细胞分泌Arg-1和其mRNA水平均显著升高(P<0.05)。SSA可降低腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球颗粒的能力(P<0.01),且具有浓度依赖性。SSA可降低M1型巨噬细胞磷酸化核转录因子-κB(phosphorylation of NF-kappaB,p-NF-κB)(P<0.01),提高M2型巨噬细胞磷酸化信号转导和转录激活因子6(phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 6,p-STAT6)(P<0.05)。结论SSA可能通过调控NF-κB和STAT6信号通路来影响M1/M2型巨噬细胞的分化和功能。
文摘为探究羊口疮病毒(ORFV)129蛋白对NF-κB信号通路介导的宿主细胞因子转录水平的影响,本研究首先设计并合成山羊4种细胞因子基因特异性引物,分别以构建的4种细胞因子重组质粒为模板,经条件优化建立了检测山羊4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。结果显示,所建立的4种细胞因子SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法熔解曲线呈单一峰,无引物二聚体;4种细胞因子重组质粒标准品最低检测限分别为IL-6:1.40×10^(2)拷贝/μL、IL-1β:1.92×10^(2)拷贝/μL、IFN-γ:1.69×10^(2)拷贝/μL、TNF-α:2.31×10^(1)拷贝/μL;组内及组间变异系数在0.1%~2.3%。表明所建立的山羊4种细胞因子荧光定量RT-PCR特异性强,灵敏度高,稳定性好,可用于4种细胞因子mRNA转录水平的检测。随后本研究将包含编码ORFV 129完整蛋白基因的重组质粒pEGFP-ORFV 129和pEGFP-N1空质粒分别转染山羊睾丸支持细胞(GTSCs)24 h后,用终浓度20 ng/mL的TNF-α刺激转染细胞6 h后收集细胞,利用建立的荧光定量RT-PCR方法检测GTSCs中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α共4种细胞因子mRNA的转录水平,结果显示,与转染pEGFP-N1空载的细胞相比,转染了pEGFP-ORFV 129重组质粒的细胞IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的转录水平均极显著下降(p<0.001),该细胞中TNF-α的mRNA转录水平也下降,但与对照组相比差异不显著(p>0.1),表明ORFV 129蛋白能够抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平。本研究通过建立山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α4种细胞因子的SYBR Green I荧光定量PCR方法,首次检测证实了ORFV 129蛋白不同程度地抑制GTSCs中NF-κB信号通路介导的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-αmRNA的转录水平,为ORFV129蛋白功能研究奠定了基础。
