将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas...将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.8472x+2.4738(R^(2)=0.9866),检出限为3.6 CFU/mL(R_(SN)=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%~104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点,为副溶血性弧菌的快速定量检测提供了一种新策略。展开更多
目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分...目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。展开更多
复合调味料食用方便、口味多样,具有巨大的市场发展潜力,但相关食品安全问题也时有发生。该研究建立了实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence-saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)熔解曲线法检测复合调味料...复合调味料食用方便、口味多样,具有巨大的市场发展潜力,但相关食品安全问题也时有发生。该研究建立了实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence-saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)熔解曲线法检测复合调味料中沙门氏菌的方法。RF-SRCA反应完成后,通过熔解曲线法检测沙门氏菌,可排除引物二聚体或非特异产物对检测结果的影响,准确直观地判定检测结果。进行引物特异性验证,并对灵敏度和人工污染样品的检出限进行分析。结果表明,该方法能有效检测沙门氏菌,14株沙门氏菌均为阳性结果,熔解峰形一致,且Tm值范围稳定,25株非沙门氏菌均为阴性结果。RF-SRCA熔解曲线方法的灵敏度为6 fg/μL,较实时荧光PCR(real-time fluorescence-PCR,RF-PCR)灵敏度高出100倍。检出限为4.6×10^(0) CFU/g,比RF-PCR低100倍。与RF-PCR方法相比,RF-SRCA检测方法灵敏度更高,检出限更低。因此,该研究建立的RF-SRCA熔解曲线方法可对复合调味料中沙门氏菌实现快速、准确、特异、灵敏的检测。展开更多
建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对...建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明:所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×10^(0)fg/μL,是传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法的1000倍,检出限为2.8×10^(0)CFU/g,是传统PCR方法的1/1000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB 4789.30—2016《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。展开更多
文摘Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用.本文利用Bst DNA聚合酶的5'→3'聚合酶、核苷酸(末端)转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA).在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA;之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3'末端沿5'→3'方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸(dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1与下游引物P2之间的缺口;然后,以下游引物P2为模板形成互补序列(RcP2);接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3'末端,形成(dNMP)n序列.继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1;如此往复,形成[P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n-…]序列.本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论.该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索.
文摘将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.8472x+2.4738(R^(2)=0.9866),检出限为3.6 CFU/mL(R_(SN)=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%~104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点,为副溶血性弧菌的快速定量检测提供了一种新策略。
文摘目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。
文摘复合调味料食用方便、口味多样,具有巨大的市场发展潜力,但相关食品安全问题也时有发生。该研究建立了实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence-saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)熔解曲线法检测复合调味料中沙门氏菌的方法。RF-SRCA反应完成后,通过熔解曲线法检测沙门氏菌,可排除引物二聚体或非特异产物对检测结果的影响,准确直观地判定检测结果。进行引物特异性验证,并对灵敏度和人工污染样品的检出限进行分析。结果表明,该方法能有效检测沙门氏菌,14株沙门氏菌均为阳性结果,熔解峰形一致,且Tm值范围稳定,25株非沙门氏菌均为阴性结果。RF-SRCA熔解曲线方法的灵敏度为6 fg/μL,较实时荧光PCR(real-time fluorescence-PCR,RF-PCR)灵敏度高出100倍。检出限为4.6×10^(0) CFU/g,比RF-PCR低100倍。与RF-PCR方法相比,RF-SRCA检测方法灵敏度更高,检出限更低。因此,该研究建立的RF-SRCA熔解曲线方法可对复合调味料中沙门氏菌实现快速、准确、特异、灵敏的检测。
文摘建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明:所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×10^(0)fg/μL,是传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法的1000倍,检出限为2.8×10^(0)CFU/g,是传统PCR方法的1/1000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB 4789.30—2016《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。
