转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用 被引量：11

1

作者 吴永彬 肖维威 +5 位作者 张宝 蔡翠霞 康文杰 周琳华 刘唐书 马文丽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期775-782,共8页

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应... 本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估.结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%～101.479%正常范围内(R2≥0.995),定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建. 展开更多

关键词 转基因 重叠延伸PCR 质粒标准分子 品系特异性检测 实时荧光定量PCR

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转基因玉米pUC57-BT11质粒标准分子的构建与适用性研究 被引量：5

2

作者 董莲华 李亮 +2 位作者 王晶 赵正宜 臧超 《计量学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期570-574,共5页

构建了含有转化体特异性片段（BT11-93bp）和玉米的内标准基因片段（zSSIIb-151bp）的质粒分子pUC57-BT11，经酶切和测序验证后，对其特异性进行检查。采用测序和荧光定量PCR法对该质粒分子进行定值，结果为1．01±0．叭（k=2）。... 构建了含有转化体特异性片段（BT11-93bp）和玉米的内标准基因片段（zSSIIb-151bp）的质粒分子pUC57-BT11，经酶切和测序验证后，对其特异性进行检查。采用测序和荧光定量PCR法对该质粒分子进行定值，结果为1．01±0．叭（k=2）。通过质粒分子和基因组DNA产生的内源和外源基因比较，发现两者标准曲线斜率无显著差异，线性相关系数均〉10．99。利用pUC57-BT11质粒分子对已知含量的转基因基体标准物质进行转基因含量测定，结果发现采用pUC57．BT11质粒分子对标准物质的测定结果与其标准值-致，表明pUC57-BT11质粒分子可作为转基因玉米BT11转化体特异性的定性和定量检测用标准物质。 展开更多

关键词 计量学 转基因玉米 BT11 质粒标准分子 标准物质

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转基因大豆MON89788检测质粒标准分子的构建与应用 被引量：7

3

作者 李飞武 邵改革 +3 位作者 邢珍娟 李葱葱 夏蔚 张明 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第23期12330-12333,共4页

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子。[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3′端特异性序列和5′端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并... [目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子。[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3′端特异性序列和5′端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证。[结果]获得了3700bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1029bp。该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10copy。[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代MON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测。 展开更多

关键词 转基因生物 质粒标准分子 MON89788大豆 转化体特异性检测

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用于检测转基因作物中调控元件的质粒标准分子的构建 被引量：3

4

作者 邢宇俊 陆丹丹 +4 位作者 吴季荣 徐剑宏 王园园 梁杰 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1392-1400,共9页

为解决转基因农产品检测中阳性标准物质匮乏的问题,利用重叠PCR技术将检测过程中常用的调控元件Ca MV35S启动子、FMV35S启动子、PAT29启动子、Ubiquitin启动子、NOS启动子、35S终止子、NOS终止子和E9终止子依次连接获得融合片段,再利用... 为解决转基因农产品检测中阳性标准物质匮乏的问题,利用重叠PCR技术将检测过程中常用的调控元件Ca MV35S启动子、FMV35S启动子、PAT29启动子、Ubiquitin启动子、NOS启动子、35S终止子、NOS终止子和E9终止子依次连接获得融合片段,再利用分子克隆技术将融合片段转化到载体p MD-19T中,获得含有调控元件的标准质粒p MD-RG。PCR和测序结果验证了标准分子构建的正确性,并且标准质粒的均匀性和稳定性比较好,符合标准物质候选物的要求,可代替阳性标准物质用于转基因成分的检测和研究。该质粒可用于大多数已经批准的转基因作物的检测和监管工作中。 展开更多

关键词 转基因作物 质粒标准分子 调控元件

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转基因番木瓜pUC57-Papaya质粒标准分子的构建与适用性研究

5

作者 潘志文 陈伟庭 +2 位作者 姚涓 王声斌 姜大刚 《计量学报》 CSCD 北大核心 2023年第3期422-429,共8页

构建了含番木瓜2个内标准基因、4个筛选靶标及3个转化体特异性片段的质粒分子pUC57-Papaya,进行了适用性验证实验。应用普通PCR和实时荧光定量PCR对其进行互换性评估;使用质粒分子对2个样品进行转基因含量测定。结果显示:质粒分子全部9... 构建了含番木瓜2个内标准基因、4个筛选靶标及3个转化体特异性片段的质粒分子pUC57-Papaya,进行了适用性验证实验。应用普通PCR和实时荧光定量PCR对其进行互换性评估;使用质粒分子对2个样品进行转基因含量测定。结果显示:质粒分子全部9个目的片段按照设计排列,序列完全一致;全部9个基因片段普通PCR和实时荧光PCR方法均能正确扩增得到预期结果,特异性、灵敏度与基因组DNA一致;全部9个基因构建标准曲线做定量测试时,与基因组DNA标准曲线斜率无显著差异,线性相关系数均大于0.99,其中内标准基因Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段的截距无差异;利用质粒分子测量2个样品的Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段拷贝数,计算转基因含量,结果与基因组DNA一致;测序结果显示各片段拷贝数比值为1,质粒DNA拷贝数浓度为(2.54±0.10)×10^(6)copies/μL。构建的标准质粒分子可代替基因组DNA用于定量检测,也可作为转基因番木瓜定性和定量检测用标准物质。 展开更多

关键词 计量学 转基因番木瓜 质粒标准分子 核酸标准物质

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转基因大豆多靶标质粒DNA标准分子的研制及应用

6

作者 刘奕君 闫伟 +3 位作者 何禹璇 董立明 龙丽坤 李飞武 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期169-183,共15页

【目的】为了确保转基因检测技术的标准化和准确性,开发一种适用于转基因大豆定性定量检测的多靶标质粒标准分子。【方法】针对13种转基因大豆转化体的分子特征信息,合成了含有多靶标序列的核酸片段,通过将外源片段插入pUC57质粒多克隆... 【目的】为了确保转基因检测技术的标准化和准确性,开发一种适用于转基因大豆定性定量检测的多靶标质粒标准分子。【方法】针对13种转基因大豆转化体的分子特征信息,合成了含有多靶标序列的核酸片段,通过将外源片段插入pUC57质粒多克隆位点并经大肠杆菌转化,研制了含有27个转基因大豆靶标序列的质粒DNA标准分子pUC57-SOY。采用普通PCR、单重、双重实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法对DNA标准分子pUC57-SOY的靶标特异性进行测试,利用13种大豆转化体进行定量检测适用范围和定值参数性能进行评估。【结果】在普通PCR检测中,质粒DNA包含的24种检测靶标,均能稳定扩增,且无非特异性扩增产物,表明质粒DNA标准分子pUC57-SOY在实际检测中具有良好的特异性;实时荧光定量PCR(qPCR)方法测试表明,质粒标准分子的不同浓度与靶标扩增效率具有良好的线性相关性。以pUC57-SOY标准分子为阳性参照物,应用标准曲线内插法,实际样品检测结果与预期相一致。【结论】开发的多靶标质粒标准分子pUC57-SOY表现出符合转基因成分定性定量检测要求的优良性能。在定性检测中,24种检测靶标均能稳定检测出并具有良好的特异性;在定量检测中,可实现一个标准分子对应13种靶标的精准测定。因此,该研究创制的质粒标准分子pUC57-SOY可作为转基因大豆检测的阳性对照品。 展开更多

关键词 转基因成分检测 转基因大豆 质粒DNA标准分子 定量

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转基因油菜T45质粒分子标准物质协同实验研究 被引量：1

7

作者 董莲华 余笑波 +4 位作者 宋贵文 曹应龙 李亮 王晶 卢长明 《计量学报》 CSCD 北大核心 2011年第B12期119-123,共5页

对转基因油菜T45荧光定量PCR方法的关键参数进行了方法验证，结果表明该方法适合于标准物质协同实验。选择6家实验室采用经过验证的方法对转基因油菜T45质粒分子标准物质进行了协同实验研究。通过比较分析转基因油菜T45基因DNA与质粒分... 对转基因油菜T45荧光定量PCR方法的关键参数进行了方法验证，结果表明该方法适合于标准物质协同实验。选择6家实验室采用经过验证的方法对转基因油菜T45质粒分子标准物质进行了协同实验研究。通过比较分析转基因油菜T45基因DNA与质粒分子DNA两者产生的标准曲线的斜率（扩增效率）、线性拟合度和截距，发现转基因油菜T45基因组DNA与质粒分子DNA具有相似的扩增效率和线性相关系数。经统计学分析各参与实验室的数据等精度，转基因油菜T45质粒分子标准物质的标准值和扩展不确定度为0．98±0．02（％=2）。 展开更多

关键词 计量学 转基因油菜 T45 质粒分子标准物质 实时荧光定量PCR

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转基因油菜Ms8质粒分子的制备 被引量：2

8

作者 余笑波 沙跃兵 +3 位作者 张江东 赵雷 陈怡 隋志伟 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期694-700,共7页

随着转基因产品的大规模商业化和我国大规模进口油菜籽,有效管控存在的风险显得非常必要和有意义,试验研究了质粒标准分子pMs8的研制过程,包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、均匀性检验、稳定性考察、定值。结果表明,该质粒分... 随着转基因产品的大规模商业化和我国大规模进口油菜籽,有效管控存在的风险显得非常必要和有意义,试验研究了质粒标准分子pMs8的研制过程,包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、均匀性检验、稳定性考察、定值。结果表明,该质粒分子标准物质的内源基因和外源基因的均匀性良好,没有扩增出所选的其他特异性基因,短期稳定性在14 d(处理温度大于25℃)发生显著变化,长期稳定性大于6个月,两种方法对外源基因拷贝数的定值结果相近,因此,p Ms8是有准确量值的质粒标准分子。可替代性研究结果表明,其可替代基因组作为转基因油菜Ms8定量的阳性标准。 展开更多

关键词 转基因油菜 数字PCR 质粒标准分子 MS8

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转基因油菜Ms8质粒分子外/内源基因比值的不确定度评定 被引量：4

9

作者 余笑波 沙跃兵 +4 位作者 张晓东 赵雷 王珂 张江东 郑坚璐 《中国测试》 北大核心 2017年第S1期15-20,共6页

数字PCR是一项不依赖校准物的DNA绝对定量技术,通过统计(泊松分布)反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数。该文对转基因油菜Ms8质粒分子进行构建和纯度分析后,采用荧光定量PCR对质粒分子的可替代性、均匀性和稳定性进行考察,采用数字PC... 数字PCR是一项不依赖校准物的DNA绝对定量技术,通过统计(泊松分布)反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数。该文对转基因油菜Ms8质粒分子进行构建和纯度分析后,采用荧光定量PCR对质粒分子的可替代性、均匀性和稳定性进行考察,采用数字PCR对质粒分子进行定值,并对测量结果进行不确定度评定。结果表明,数字PCR测得pMs8的外源基因和内源基因的比值及其不确定度为1.12±0.13,k=2。 展开更多

关键词 数字PCR 质粒标准分子Ms8 不确定度

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转基因水稻标准质粒分子的构建与分析 被引量：2

10

作者 刘晋 邓汉超 +5 位作者 王学林 侯红利 李永红 杨启鹏 陈惠芳 周向阳 《中国种业》 2016年第12期52-55,共4页

针对目前转基因（GM）产品检测标准分子的缺乏，构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻内源基因腓通用序列，耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠... 针对目前转基因（GM）产品检测标准分子的缺乏，构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻内源基因腓通用序列，耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠性进行鉴定研究，研究结果显示，在进行普通PCR扩增时，采用质粒标准分子为阳性对照，均能特异扩增目的条带。以标准质粒分子构建的标准曲线，sPs基因的定量标准曲线的相关系数平均为0．9993，PCR扩增效率在1．0004～1．034之间；ThST3基因的定量标准曲线的相关系数平均为0．9937，PCR扩增效率在0．9358～0．9486之间。因此，构建的标准分子pMDSPS和pMDTheli既能作为普通PCR的阳性对照，也能用于定量标准曲线的构建，为转基因水稻的定量检测提供简便、价格低廉的标准分子打下基础。 展开更多

关键词 标准质粒分子 实时荧光PCR 标准曲线 PCR效率

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油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905的研制及应用 被引量：1

11

作者 翟杉杉 李夏莹 +7 位作者 王颢潜 李俊 陈子言 高鸿飞 李允静 吴刚 张秀杰 武玉花 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期99-109,共11页

转基因油菜是我国转基因生物安全监管的重要对象,为了解决检测机构常常面临的标准物质(样品)缺乏困境,统计我国批准进口和正在申请安全证书的11个转基因油菜品种,分析分子特征和相应的检测标准方法,确定每个转基因油菜品种的检测靶标序... 转基因油菜是我国转基因生物安全监管的重要对象,为了解决检测机构常常面临的标准物质(样品)缺乏困境,统计我国批准进口和正在申请安全证书的11个转基因油菜品种,分析分子特征和相应的检测标准方法,确定每个转基因油菜品种的检测靶标序列。将11个转基因油菜品种的检测靶标序列通过基因合成的方法融合构建到pUC18载体上,研制出阳性质粒分子pYCID-1905,为转基因油菜的转化体鉴定检测提供了通用的阳性对照分子。结果发现,该质粒分子可同时用作国家标准(GB/T)、农业农村部公告、进出口检验检疫标准(SN/Y)和欧盟标准中普通PCR方法和实时荧光PCR方法的阳性对照,可以解决转基因油菜检测中缺乏标准样品的难题。 展开更多

关键词 转基因油菜 转化体鉴定 标准质粒分子 实时荧光PCR 普通PCR

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转基因番茄Zeneca B,Da,F实时荧光定量PCR检测体系的建立 被引量：4

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作者 麦荣嘉 陈敏芳 +7 位作者 莫倩珍 胡良勇 黎事伦 唐敏然 顾晓敏 蔡永洪 周伦彬 周晓红 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期587-593,共7页

目的构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系。方法基于反向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列(ERG-apx),转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列(GS-pg)及其构建特异性... 目的构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系。方法基于反向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列(ERG-apx),转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列(GS-pg)及其构建特异性序列(CS-16S、CS-16A)的番茄内参质粒标准分子pEasy-T3-APX,转基因番茄B,Da,F品系的构建特异性质粒标准分子pEasy-T3-16A、pEasy-T3-16S;以Beacon Designer 7.5设计用于定性PCR和qPCR检测的引物对和Taqman探针;基于质粒标准分子建立了定性PCR和qPCR检测体系,对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指标进行评估;使用PicoGreen试剂盒对质粒标准分子进行定量,以质粒pEasy-T3-APX为背景DNA定量混有pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制备成含量为1%和0.1%(w/w)的两组核酸标准物质,进行所构建qPCR检测体系的定量性能评价。结果锚定qPCR检测靶序列:ERG-apx 108 bp,GS-pg 108 bp,CS-16S 109 bp、CS-16A 102 bp;酶切鉴定所构建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段;所建立的实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系,重复性的相对标准差(RSD)0.2%～1.5%,检测下限25 copies,标准曲线方程线性关系R2值在0.994～0.998,效率在93.3%～102.4%。经换算系数Cf换算,对PicoGreen定量的样品进行验证,其实测值与真值的偏差是-9.7%～17.3%。结论成功构建了转基因番茄Zene-ca B,Da,F品系的质粒标准分子及其qPCR检测体系,为转基因番茄Zeneca B,Da,F品系转基因成分的监测建立了可行的可供使用的定性与定量检测体系。 展开更多

关键词 质粒标准分子 转基因番茄 核酸检测技术 荧光定量PCR

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