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小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒的构建 被引量:6
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作者 杨巍 刘林林 +5 位作者 孙婷 李秀娟 田梅 朴春姬 潘艳 李修义 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期17-19,共3页
目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1... 目的 :克隆小鼠内皮抑素 (m Endostatin)编码区 c DNA序列并构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和 m Endo-statin双基因表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应法 (RT- PCR) ,以小鼠肝细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m Endostatin,与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建含 Egr- 1启动子的 IFNγ和m Endostatin双基因表达质粒。结果 :经测序证实获得的 m Endostatin序列与文献报道完全一致 ,并构建了含 Egr-1启动子的 IFNγ和 m Endostatin双基因表达质粒 p Egr- IFNγ- m Endostatin。结论 :利用 RT- PCR法成功克隆了m Endostatin的 c DNA序列 ,构建了 p Egr- IFNγ- m Endostatin重组双基因表达质粒。 展开更多
关键词 内皮抑素 质粒/遗传学 干扰素Ⅱ型 EGR-1 pEgr—IFNγ-mEndostatin
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野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱 被引量:3
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作者 舒莉萍 何志旭 +3 位作者 姚冬静 马健娟 李涛 叶芝旭 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期69-74,共6页
目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基... 目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h~72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。 展开更多
关键词 寡核苷酸类 反义/遗传学 原位杂交 基因表达 斑马鱼 胚胎发育 遗传载体 质粒/遗传学 转染 内皮 血管/细胞学
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抗HIF-1α和survivin基因双靶位miR-RNAi载体的构建及其对胰腺癌细胞的作用 被引量:4
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作者 徐孙兵 朱一平 +1 位作者 牟一平 朱玲华 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期81-88,共8页
目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响。方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列... 目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响。方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列,连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒,构建两组共8个载体,依次为anti-H(Ⅰ)、anti-H(Ⅱ)、anti-H(Ⅲ)、anti-H(Ⅳ)和anti-S(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)、anti-S(Ⅲ)、anti-S(Ⅳ)。实时定量RT-PCR检测靶基因mRNA的表达水平,将两组中mRNA下调作用最强的质粒串联,构建anti-H+S。用anti-H+S及mRNA下调作用最强的anti-H和anti-S转染胰腺癌Panc-1细胞,Western blot测定靶蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖活性。结果:经测序鉴定,所有anti-H、anti-S及双靶位质粒anti-H+S装载位点核苷酸序列与设计序列完全相符。anti-H的靶基因mRNA沉默效率依次为48%、2%、44%和30%;anti-S的靶基因mRNA沉默效率依次为72%、75%、58%和59%。由anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)串联得到双靶位质粒anti-H+S。anti-H+S的靶基因mRNA沉默效率为53%(HIF-1α)和42%(survivin)。anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)及anti-H+S与对照质粒相比均使靶基因蛋白的表达明显下降,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。其中anti-H+S对细胞的增殖抑制作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ),72h后差异有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究成功构建了抗HIF-1α和Survivin的单靶位质粒和双靶位质粒;其中,anti-H+S抑制胰腺癌Panc-1细胞增殖作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)。 展开更多
关键词 胰腺肿瘤/遗传学 微管相关蛋白质类/遗传学 缺氧诱导因子1/遗传学 基因表达 遗传载体 质粒/遗传学 转染 肿瘤细胞 培养的 RNA干扰 微RNAs
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日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因的克隆、表达和初步鉴定 被引量:4
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作者 潘丽红 朱绍春 +5 位作者 任翠平 王晓楠 赵志荣 刘淼 汪学龙 沈际佳 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第3期262-264,共3页
目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Ts4样融合蛋白。方法提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因编码序列,T载体连接,将其亚克隆入PGEX-5X-1载体中,... 目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Ts4样融合蛋白。方法提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因编码序列,T载体连接,将其亚克隆入PGEX-5X-1载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌DH5α并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约为870bp的片段,表达质粒PGEX-5X-1-SjTs4经双酶切和以该重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约58ku大小的GST融合蛋白条带,并可与抗GST特异性抗体反应。结论本实验成功地克隆了日本血吸虫Sj-Ts4样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。 展开更多
关键词 血吸虫 日本/免疫学 克隆 分子 质粒/遗传学
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三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究 被引量:3
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作者 何星 李华 +5 位作者 邵雁 胡莹 顾子春 陈力 马菁晶 兰志勇 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期660-665,共6页
目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察... 目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。结果:HilyMax组的转染效率为(86.85%±2.32%),较Lipofectamin2000组(48.33%±3.24%)、Gbfectene-Elite组(37.35%±5.41%)高(F=18.882,P<0.05);其中,HilyMax 2.5μl组的转染效率最高为(90.53%±1.15%)。Lipofectamin2000组的细胞存活率(65.76%±5.78%)明显低于HilyMax组(89.54%±0.86%)、Gbfectene-Elite组(82.45%±3.56%)(F=90.676,P<0.05)。结论:HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5μl HilyMax:1μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。 展开更多
关键词 转染 质粒DNA/遗传学 鸡胚成纤维细胞/细胞学 绿色荧光蛋白质类 细胞毒性
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