AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达 被引量：4

1

作者 常英英 高亚南 +3 位作者 梁立雄 丁昌俊 苏晓华 张冰玉 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期75-79,共5页

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结... 以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。 展开更多

关键词 pER8-DME1 17-Β-雌二醇 化学诱导表达载体 瞬时表达

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乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定 被引量：7

2

作者 郝凤奇 李景梅 杨桂连 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期624-628,共5页

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA... 为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 诱导表达载体 NISIN

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小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建 被引量：2

3

作者 李明 丁博 +5 位作者 牛有雄 吕芳芳 杨文丽 Silin Zhong 孙守钧 谢晓东 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期17-22,共6页

以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守... 以小麦品种扬麦158为材料,根据NCBI中小麦TaWRKY46基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦总RNA中分离了大小为870 bp的cDNA片段。测序表明,该片段与NCBI中已克隆的小麦TaWRKY46基因高度同源,包含完整的读码框,值得注意的是此蛋白保守氨基酸序列WRKYGQK突变为WRKYGEK,为TaWRKY46的新等位基因,命名为TaWRKY46-1。采用Gateway克隆技术构建了该基因的可诱导型超量表达载体,并转化农杆菌,为接下来转基因验证TaWRKY46-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 小麦 WRKY转录因子 Gateway克隆技术 可诱导表达载体

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去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

4

作者 常英英 梁立雄 +4 位作者 高亚南 王颜波 丁昌俊 苏晓华 张冰玉 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期717-723,共7页

植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子,参与基因的表达调控,与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因,采用"酶切—连接"的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ... 植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子,参与基因的表达调控,与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因,采用"酶切—连接"的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-ROS1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明:17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-ROS1中目的基因的表达,17-β-雌二醇最佳诱导浓度为50~100μmol·L^(-1);随着诱导时间的延长,目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高。该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。 展开更多

关键词 pER8-ROS1 17-Β-雌二醇 化学诱导表达载体 瞬时表达

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低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究 被引量：1

5

作者 殷爱红 武文琦 +2 位作者 崔世军 滕旭 郑少鹏 《首都医科大学学报》 CAS 2012年第3期356-360,共5页

目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表... 目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内,并于不同时间点进行后肢胫动脉血压测量和动脉血管造影。结果与对照组相比,应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉血管造影显示基因治疗组动脉充盈早于对照组,新生血管多于对照组,早于对照组建立侧支循环。结论低氧诱导VEGF基因表达载体可促进家兔肢体缺血模型新生血管的形成,改善缺血肢体的血液循环。 展开更多

关键词 低氧诱导表达载体 血管内皮细胞生长因子 肢体缺血 基因治疗

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炎症诱导性表达载体的表达特性 被引量：1

6

作者 李泉 俞卫锋 +4 位作者 黄晶 吕欣 张中军 王红阳 吴孟超 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期648-651,共4页

目的 :构建一种具有自控性的炎症诱导性表达载体 ,为探索符合临床实际的抗炎基因治疗新系统奠定基础。 方法 :(1)将对炎症敏感的 SAA3启动子调控片段与报告基因 CAT片段重组 ,构建炎症诱导性表达载体 p SAA3/CAT;(2 )用脂质体转染法将... 目的 :构建一种具有自控性的炎症诱导性表达载体 ,为探索符合临床实际的抗炎基因治疗新系统奠定基础。 方法 :(1)将对炎症敏感的 SAA3启动子调控片段与报告基因 CAT片段重组 ,构建炎症诱导性表达载体 p SAA3/CAT;(2 )用脂质体转染法将表达载体 p SAA3/CAT转入体外培养细胞或动物体内 ,观察不同时间、不同剂量的炎性刺激时报告基因的表达变化 ,分析 SAA3启动子体内外转录活性和炎症诱导性。 结果 :(1)阳离子脂质体包裹表达质粒可以有效地转染肝源性细胞SMMC- 772 1和单核细胞源性细胞 U937,经活化后的 U 937细胞可迅速表达 CAT,6 h启动 ,2 4 h达峰值 ,72 h渐降至基础水平。(2 )腹腔注射脂质体包裹 DNA可有效转染外源报告基因 CAT在体内表达 ;L PS活化的基因转染小鼠肝脏中的 CAT表达与一次典型的急性反应时间一致 ,鼠肝 CAT表达水平与 L PS有显著的剂量依赖关系。 结论 :初步建立了一种具有自控性的有效抗炎基因治疗新系统。 展开更多

关键词 炎症 诱导性表达载体 基因疗法 淀粉样蛋白 SAA 脓态症

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四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定 被引量：1

7

作者 任淑婷 于琳华 +1 位作者 徐长福 高广道 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1443-1445,共3页

目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载... 目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。 展开更多

关键词 人肝细胞生长因子 四环素诱导性真核表达载体 基因治疗

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一株受二噁英类化合物诱导表达绿色荧光蛋白的胃癌细胞系的建立 被引量：2

8

作者 汪畅 王英 +3 位作者 雷垚 张捷 郑明辉 梁勇 《生态毒理学报》 CAS CSCD 2008年第3期244-249,共6页

将人工合成的5个相连的XRE(Xeobiotic response element)和minimal CMV(Human cytomegalovirus)启动子,插入载体pEGFP-1,构建得到载体pXRE5-EGFP.以pXRE5-EGFP转染人胃癌细胞SGC-7901,经过筛选得到一株受2,3,7,8-四氯代二苯并二英(2,3,7... 将人工合成的5个相连的XRE(Xeobiotic response element)和minimal CMV(Human cytomegalovirus)启动子,插入载体pEGFP-1,构建得到载体pXRE5-EGFP.以pXRE5-EGFP转染人胃癌细胞SGC-7901,经过筛选得到一株受2,3,7,8-四氯代二苯并二英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导表达绿色荧光蛋白的细胞系XRE5-SGC-7901.将XRE5-SGC-7901细胞株暴露于不同浓度TCDD(0、250、500pg·mL-1)中,发现TCDD暴露组XRE5-SGC-7901细胞中绿色荧光蛋白的表达量显著升高,且与TCDD暴露浓度呈正相关.新构建的细胞株具有二英类化合物诱导表达绿色荧光蛋白的功能. 展开更多

关键词 二噁英类化合物 诱导表达载体 绿色荧光蛋白

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TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立 被引量：2

9

作者 阮红峰 应忠明 罗环 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1035-1036,共2页

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿... 神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移,并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现,TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达,且随着NB的恶化,表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。 展开更多

关键词 TAZ基因 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 诱导过表达慢病毒载体

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AtMET1基因克隆及化学诱导表达分析 被引量：2

10

作者 梁立雄 常英英 +4 位作者 高亚南 王颜波 张伟溪 苏晓华 张冰玉 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2016年第6期946-950,共5页

DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1（DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene）是在植物中最早分... DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1（DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene）是在植物中最早分离出来的甲基化相关基因,编码DNA甲基化转移酶1（MET1,Methytransferase1）,该酶主要负责保持CG位点的甲基化,通过DNA甲基化作用影响植物的基因组结构、发育和进化。 展开更多

关键词 pER8-MET1 17-Β-雌二醇 化学诱导表达载体 瞬时表达

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联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

11

作者 钟胜 段瑞军 +2 位作者 郭建春 胡新文 符少萍 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第1期52-54,共3页

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3... [目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。 展开更多

关键词 CBF3冷诱导表达载体 CBF3和AtGolS3双基因表达载体 拟南芥转化

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北非蝎昆虫毒素AaHIT1基因的原核表达和转基因分析 被引量：9

12

作者 苏力坦·阿巴白克力 姬生健 朱玉贤 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期182-185,共4页

将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaH... 将北非蝎昆虫毒素 (AndroctonusaustralisHectorinsecttoxin ,AaHIT1)基因克隆入温度诱导表达载体pBV2 2 0 ,并在宿主菌E .coliDH5α中进行诱导表达 .表达定位分析发现 ,AaHIT1大部分存在于包涵体中 .蛋白质N 端测序证实了体外表达的AaHIT1蛋白的正确性 .将AaHIT1基因转化入烟草中并获得了转基因植株 ,基因组PCR、RT PCR及Northern印迹分别证实AaHIT1基因已正确地插入到烟草基因组中并已得到表达 .抗虫实验表明 ,该转基因烟草对白粉虱有明显的抗性 . 展开更多

关键词 北非蝎昆虫毒素 基因表达 原核表达 温度诱导表达载体 包涵体 AaHIT1 抗虫基因 转基因作物

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上调巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能 被引量：4

13

作者 郑修军 王琦 +1 位作者 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1022-1026,共5页

目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表... 目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染巨噬细胞,经梯度浓度强力霉素(DOX)诱导,免疫荧光技术检测巨噬细胞FcγRⅡB表达,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。经不同浓度DOX诱导后的腹腔巨噬细胞分别检测吞噬和趋化功能。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。表达和调节病毒滴度均达到106转导单位/m L。巨噬细胞被病毒感染后经DOX诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示,FcγRⅡB能够在巨噬细胞表达;实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FcγRⅡB表达水平与DOX浓度呈正相关。巨噬细胞的吞噬和趋化功能与FcγRⅡB表达呈负相关。结论调节巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 抑制性受体 巨噬细胞 吞噬和趋化

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含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达 被引量：2

14

作者 刘慧宇 曹秀琴 杨志伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期561-564,568,共5页

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导... 目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。 展开更多

关键词 FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 调控表达

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构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究 被引量：1

15

作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期297-301,共5页

目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-... 目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。 展开更多

关键词 诱导型CRISPR/Cas9系统 Dox诱导型sgRNA表达载体 造血干细胞 基因编辑 巨噬细胞

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整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立

16

作者 张曼玲 陈袁 +6 位作者 赵丽华 李艳如 金永 王俊政 姜海滨 陈俏羽 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2017年第11期1377-1384,共8页

目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝... 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。 展开更多

关键词 猪转录因子 2A肽基因序列 诱导表达载体 转基因细胞系 IPS细胞

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乳酸乳球菌高效电转化方法的建立 被引量：8

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作者 任大勇 李昌 +5 位作者 秦艳青 杜寿文 郭欢欢 刘宏锋 洛阳 金宁一 《中国兽药杂志》 2012年第1期5-9,共5页

以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影... 以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Ω、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2 mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉冲时间分别为10 kV/cm和5 ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2 h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×104 CFU/μg DNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。 展开更多

关键词 乳酸乳球菌 电转化 转化效率 感受态细胞 诱导型表达载体

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