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构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究 被引量：1
1
作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期297-301,共5页
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-... 目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。 展开更多
关键词 诱导型crispr/cas9系统 Dox诱导型sgRNA表达载体 造血干细胞 基因编辑 巨噬细胞
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基于CRISPR/Cas9系统构建BT细胞HSP70基因敲除质粒及其功能验证
2
作者 陈金纬 陈楠楠 +4 位作者 白彤彤 周玉龙 张泽财 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第4期24-29,共6页
牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种牛类接触性传染病。研究以牛的热休克蛋白70(Heat shock protein,Hsp70)基因为靶标,构建特异性gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为构建牛Hsp70敲除质粒奠定基础。首先... 牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种牛类接触性传染病。研究以牛的热休克蛋白70(Heat shock protein,Hsp70)基因为靶标,构建特异性gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为构建牛Hsp70敲除质粒奠定基础。首先针对牛Hsp70A1A的CDS区域为模板,CDS区域全长1926bp,只有一个外显子,针对该外显子设计3对sgRNA序列,构建重组质粒。筛选出最优sgRNA后,利用LentiCRIPSR-V2-mCherry质粒转染HEK-293T细胞,通过观察荧光强度确定最佳转染比例,随后将构建的重组质粒转染至牛鼻甲骨细胞(BT),经过嘌呤霉素加压筛选后,提取细胞总蛋白,利用Western Blot检测BT细胞中Hsp7O蛋白表达情况。结果显示:所设计的sgRNA成功插人到LentiCRISPR-V2质粒中,测序结果正确,重组质粒构建成功。Western Blot结果表明,经过嘌呤霉素筛选后的BT细胞中Hsp70蛋白水平降低。最终成功构建靶向牛Hsp70基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除Hsp70A1A基因功能验证成功,为后续研究Hsp70对BVDV复制的影响奠定基础。 展开更多
关键词 牛 HSP70 基因敲除 crispr/cas9系统
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CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的研究进展
3
作者 解雅茹 金昊延 +2 位作者 孔辰 蔡蓓 张令锴 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期479-491,共13页
生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性... 生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性。与其他基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的研究较为深入。CRISPR/Cas技术已在多项研究中取得突破性进展,被视为一种极有潜力的育种改良手段。本文主要针对两种CRISPR/Cas系统及CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用进行综述,对家畜生殖细胞形成过程进行简要概括,阐述CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的原理、构成和衍生技术,介绍CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用,对基因编辑技术广泛应用于家畜生殖细胞进行展望,旨在为未来畜牧基因编辑领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 基因编辑技术 crispr/cas9系统 crispr/cas12系统 家畜生殖细胞
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CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展
4
作者 张莹莹 王楚雯 钱国清 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第1期173-180,共8页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 支气管上皮细胞 基因编辑
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基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证 被引量：1
5
作者 张静远 姜晓龙 崔淑芳 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期202-209,共8页
目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-... 目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。 展开更多
关键词 裸鼹鼠 HIF-1Α 基因敲除 crispr/cas9系统
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质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞系基因编辑中的应用
6
作者 顾开妍 徐海晶 +4 位作者 陶欣然 吴璨 魏静 桂朗 李名友 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期3381-3391,共11页
【目的】检测质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞(ObSSCs)和斑马鱼胚胎中的基因编辑效果,为开展基因编辑的SSCs移植提供技术支撑,进而推动养殖鱼类基因编辑育种工作的快速发展。【方法】将靶向红色荧光蛋白(RFP)的gRNA整合至可用于... 【目的】检测质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞(ObSSCs)和斑马鱼胚胎中的基因编辑效果,为开展基因编辑的SSCs移植提供技术支撑,进而推动养殖鱼类基因编辑育种工作的快速发展。【方法】将靶向红色荧光蛋白(RFP)的gRNA整合至可用于体内外基因编辑的整合质粒pCas9-zU6sgRNA(带有支架序列的向导RNA,由来自斑马鱼的U6启动子驱动)和报告质粒pCVpf-gRNA(向导RNA)中,然后分别转染ObSSCs和显微注射斑马鱼胚胎,通过荧光显微镜观察和PCR检测质粒CRISPR/Cas9系统在ObSSCs及斑马鱼胚胎中的基因编辑效果。【结果】以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共转染正常ObSSCs及pCVpr质粒转染ObSSCs,在ObSSCs中能观察到绿色荧光,且在表达绿色荧光蛋白(GFP)的ObSSCs中观察到红色荧光信号明显减弱,而不转染质粒的ObSSCs未观察到绿色荧光信号;随着整合质粒pCas9-zU6sgRNA转染剂量由340 ng增加到410 ng,其基因编辑效率由0.10%增加到0.63%;此外,质粒CRISPR/Cas9系统在基因组中的编辑效率与在外源质粒中的编辑效率基本一致。为进一步检测质粒CRISPR/Cas9系统在体内的编辑效率,以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共注射斑马鱼胚胎,24h后能观察到绿色荧光信号,而空白对照组和阴性对照组斑马鱼胚胎均未观察到绿色荧光信号。对ObSSCs和斑马鱼的基因编辑效果进行PCR验证,发现试验组均能检测到修复的GFP片段,而空白对照组未检测到修复的GFP片段。此外,整合质粒pCas9-zU6sgRNA在斑马鱼胚胎中的基因编辑效率显著高于ObSSCs(100%vs 0.63%)(P<0.05)。【结论】由整合质粒p Cas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA构成的质粒CRISPR/Cas9系统能在ObSSCs中直观评估基因编辑效率,且质粒CRISPR/Cas9系统在同为鲤科鱼类斑马鱼胚胎中的基因编辑效率高达100%。因此,质粒CRISPR/Cas9系统可用于马口鱼和斑马鱼的sgRNA筛选,为创制养殖鱼类新品种(系)提供新思路。 展开更多
关键词 马口鱼 精原干细胞(SSCs) 基因编辑 质粒crispr/cas9系统 斑马鱼
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CRISPR/Cas9基因编辑系统在作物抗性品种选育中的应用 被引量：1
7
作者 张龑 禹娟红 《现代农业科技》 2024年第22期129-137,共9页
CRISPR/Cas9基因编辑技术因周期短、效率及精确度高、载体构建简单等优点,成为目前作物抗性品种选育的最佳分子育种工具。概述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基本原理,分析总结了该系统在作物抗旱性、抗盐性、抗冷性、抗重金属盐及抗除草... CRISPR/Cas9基因编辑技术因周期短、效率及精确度高、载体构建简单等优点,成为目前作物抗性品种选育的最佳分子育种工具。概述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基本原理,分析总结了该系统在作物抗旱性、抗盐性、抗冷性、抗重金属盐及抗除草剂品种选育中的应用,以期为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术选育更多优质作物抗性品种提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas9基因编辑系统 作物育种 突变体 抗逆性 基因编辑技术
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利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系
8
作者 乔延召 刘凯 +3 位作者 李清华 黄建豪 卫恒习 张守全 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期1-8,共8页
【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行2... 【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。 展开更多
关键词 猪 Tet-on系统 crispr/cas9系统 Sohlh1 基因敲除
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基于CRISPR/Cas9系统的Met-mcherry果蝇制备及其表达分析
9
作者 王顺鑫 侯天兰 +1 位作者 陈金霞 何倩毓 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第6期93-100,共8页
保幼激素(juvenile hormone,JH)作为昆虫变态发育中的关键激素,其核内信号的传递主要依赖于胞内受体Methoprene-tolerant(Met)。JH生理功能的发挥取决于Met的组织定位。然而,受限于Met抗体的制备,目前有关Met的组织定位仍无法确定。实... 保幼激素(juvenile hormone,JH)作为昆虫变态发育中的关键激素,其核内信号的传递主要依赖于胞内受体Methoprene-tolerant(Met)。JH生理功能的发挥取决于Met的组织定位。然而,受限于Met抗体的制备,目前有关Met的组织定位仍无法确定。实验采用CRISPR/Cas9系统,将红色荧光蛋白(mcherry)编码序列插入Met基因C末端,使果蝇表达Met-mcherry融合蛋白,构建获得原位表达Met-mcherry的果蝇品系。利用mcherry抗体从而可真实准确地反应Met的时空表达情况。免疫荧光染色结果发现游走早期,Met-mcherry主要定位于果蝇唾液腺、触角盘、前胸腺、脂肪体、神经索、腿盘等组织中。亚细胞定位结果表明,在果蝇游走期和产卵后96 h,Met-mcherry分别定位于细胞核和细胞质中,并且JH可促进Met-mcherry由细胞质转移至细胞核中。研究可为深入了解Met的功能提供基础。 展开更多
关键词 黑腹果蝇 MET crispr/cas9系统 组织定位
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CRISPR/Cas9基因编辑及其在农业领域的应用 被引量：2
10
作者 刘悦 兰英 +5 位作者 李青超 赵秀梅 刘洋 王立达 王俊强 韩业辉 《黑龙江农业科学》 2024年第10期95-101,共7页
为提高作物产量及品质,基因编辑技术被广泛应用。成簇规律间隔短回文重复及关联蛋白(CRISPR/Cas9)系统是细菌、古细菌抵御外源物质入侵的获得性免疫系统,是继锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TAL)以后的第三代基因编辑技... 为提高作物产量及品质,基因编辑技术被广泛应用。成簇规律间隔短回文重复及关联蛋白(CRISPR/Cas9)系统是细菌、古细菌抵御外源物质入侵的获得性免疫系统,是继锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TAL)以后的第三代基因编辑技术。本文就CRISPR/Cas9系统的历史起源,以及CRISPR/Cas9系统的基因结构,其中包括CRISPR相关核酸酶(Cas9)、特异性CRISPR RNA(crRNA)以及反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)进行概述;同时对该系统的作用原理,从间隔序列的获取阶段、表达阶段及免疫干扰阶段进行综述;另外对该系统在功能基因研究、基因组学筛选等领域,以及农业等相关领域的应用方面也展开了讨论,并对其将会产生的风险(脱靶效应)及解决方法进行总结,以期为农作物品种选育及功能基因的挖掘奠定基础。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 基因编辑 农业 脱靶效应
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CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估 被引量：23
11
作者 谢胜松 张懿 +4 位作者 张利生 李广磊 赵长志 倪攀 赵书红 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1125-1136,共12页
基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small gu... 基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 基因组编辑 sgRNA 脱靶效应
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CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用 被引量：12
12
作者 王玮玮 刘瑞琪 +3 位作者 吴勇延 杨严格 王勇胜 卿素珠 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1299-1305,共7页
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统是由一种短小RNA调控的对DNA修饰的基因编辑工具,是一种较锌指核酸酶(Zinc-fingers nuclease,ZFN)和转录激活因子样效应物... CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统是由一种短小RNA调控的对DNA修饰的基因编辑工具,是一种较锌指核酸酶(Zinc-fingers nuclease,ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like(TAL)effector nucleases,TALEN)打靶更加快速、高效、精准的新型基因组编辑工具,它易于设计,且具有特异性。本文回顾了CRISPR/Cas系统的结构与功能,概述了Cas9的设计策略、影响Cas9基因编辑效率的因素、脱靶检测分析方法及其在动物基因编辑研究中的应用。基于CRISPR/Cas9已经在多种动物上成功实现了基因编辑,它有望成为建立动物模型和研究疾病防治的一种新型可行性途径。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 基因编辑 sgRNA 基因敲除 基因敲入 动物模型
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CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展 被引量：7
13
作者 张蕾 张海波 +4 位作者 章敬旗 张扬 常国斌 陈国宏 王健 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第1期140-147,共8页
CRISPR/Cas系统是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫系统,由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成。在此基础上... CRISPR/Cas系统是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫系统,由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成。在此基础上改造获得的CRISPR/Cas9基因定点编辑技术可通过设计小的单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)对目标基因进行定向编辑。家禽作为农业经济动物,能够快速高效地生产蛋和肉产品,是世界范围内重要的蛋白质来源,也是极具价值的脊椎动物发育生物学模型。但是受限于卵生动物特点,家禽的受精卵与蛋黄表面紧密结合,未受精的卵子非常难取出,对家禽单细胞阶段受精卵进行靶向遗传修饰的可行性较低,因而家禽功能基因及转基因研究进展较为缓慢。CRISPR/Cas9基因定点编辑技术相较于其他基因编辑系统操作简单,靶向效率高,极大地推动了家禽功能基因的研究进展,是目前筛选和验证家禽功能基因的最有效的工具之一。文章综述了近年来CRISPR/Cas9在家禽细胞、生长发育和性腺分化、家禽疾病、家禽胚胎编辑和转基因家禽制备上的研究进展,以期为CRISPR/Cas9在家禽上的深入研究和应用提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 家禽 基因组编辑 转基因
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利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建肺部EZH2基因敲除小鼠 被引量：3
14
作者 孟凡荣 赵丹 +1 位作者 周清华 刘喆 《中国肺癌杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期358-364,共7页
背景与目的已有的研究证明CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)系统是一种能够在哺乳动物细胞中高效操作的新型基因编辑技术,应用人工设计的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)... 背景与目的已有的研究证明CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)系统是一种能够在哺乳动物细胞中高效操作的新型基因编辑技术,应用人工设计的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白与靶点DNA特异性结合以实现对基因组DNA的切割,被切割后的基因组DNA通过非同源重组或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、或者外源基因的敲入等目标。本研究的目的是应用CRISPR/Cas9技术构建小鼠肺部EZH2基因敲除的动物模型。方法针对EZH2基因的编码区,设计两个靶向EZH2基因Exon3和Exon4的sgRNA,通过慢病毒包装、感染细胞、SURVEYOR assay等一系列体外实验,验证所设计的sgRNA的有效性。应用支气管插管的方式把慢病毒灌注到小鼠肺部,利用免疫组化方法和qRT-PCR进行检测。结果 NIH-3T3细胞的体外实验结果验证了实验所设计的sgEZH2能够有效地在体外细胞系中介导Cas9切割靶DNA;小鼠支气管插管实验及肺部组织免疫组化和qRT-PCR方法检测EZH2基因敲除的效率,发现实验组小鼠肺部组织EZH2表达明显降低。结论本研究成功设计了两条能够敲除EZH2功能的sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功建立了肺部EZH2基因敲除的小鼠模型,为研究EZH2的功能和作用机制提供了有效的动物模型。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 EZH2 sgRNA 基因敲除
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CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用 被引量：17
15
作者 李金环 寿佳 吴强 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期992-1002,共11页
源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9(Cas9),CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单... 源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9(Cas9),CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、费用低廉等巨大优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。本文重点介绍了CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段靶向编辑方面的研究和应用,主要包括DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位,这一有效的DNA片段编辑方法为研究基因功能、调控元件、组织发育和疾病发生发展提供了有力手段。本文最后展望了Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的应用前景和其他类型CRISPR系统的应用潜力,为开展利用基因组DNA片段靶向编辑进行基因调控和功能研究提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 DNA片段编辑 基因功能 调控元件 疾病发生
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CRISPR/Cas9系统:基因组定点编辑技术及其在植物基因功能研究中的应用 被引量：13
16
作者 包爱科 白天惠 +1 位作者 赵天璇 苏家豪 《草业学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期190-200,共11页
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。相比锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs),基于RNA指导的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路,在基... CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。相比锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs),基于RNA指导的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路,在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等显著优点。本文从CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制及其在植物基因功能研究和作物遗传育种中的应用等方面进行了简述,最后对该系统的发展前景进行了展望。 展开更多
关键词 基因编辑 crispr/cas9系统 基因功能 分子育种
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应用CRISPR/Cas9系统敲除PD-1基因对人T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ的影响 被引量：2
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作者 龚福生 许扬梅 +2 位作者 刘施佳 黄丽洁 郑秋红 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期656-661,共6页
目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的... 目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞,测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T细胞增殖活力,ELISA检测T细胞分泌IFN-γ情况。结果:体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 m RNA核转染T淋巴细胞,测序证实PD-1基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1分子的表达水平[(9.6±1.85)%vs(16.2±2.05)%,P<0.05],PD-1基因敲除不影响T细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05);但PD-1-sgRNA组的效应T细胞分泌IFN-γ水平显著升高(P<0.01)。结论:CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1基因,降低PD-1分子表达可阻断PD-1/PD-L1负性调控从而增强T细胞的免疫活性,且促进效应T细胞分泌IFN-γ。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 T淋巴细胞 核转染 PD-1 基因敲除 IFN-Γ
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利用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母的研究进展 被引量：2
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作者 陈小玲 廖东庆 +3 位作者 黄尚飞 陈英 芦志龙 陈东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期148-158,共11页
酿酒酵母是常用的工业生产菌株,改造酿酒酵母以提高其生产性能极为重要。然而,传统的改造方法存在步骤繁琐、周期长等问题。CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌发现的自适应防御系统。目前CRISPR/Cas9系统已经成为基因组编辑的有力工具,... 酿酒酵母是常用的工业生产菌株,改造酿酒酵母以提高其生产性能极为重要。然而,传统的改造方法存在步骤繁琐、周期长等问题。CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌发现的自适应防御系统。目前CRISPR/Cas9系统已经成为基因组编辑的有力工具,能够同时改造酿酒酵母的多个基因。本文综述CRISPR/Cas9系统各组分的作用和系统的构建,介绍sgRNA靶序列的设计原则和代表性设计工具,总结对酿酒酵母进行多基因编辑的策略,以及CRISPR/Cas9系统存在脱靶和编辑效率低的问题和应对展望,为更好地应用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统的构建 多基因编辑 靶序列的设计 脱靶
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提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率方法的研究进展 被引量：2
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作者 赵盼盼 王丽 +2 位作者 袁园园 常卫东 王林嵩 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第1期12-15,共4页
近年来,CRISPR/Cas9系统经过一系列改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,目前,该技术已成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,但是该技术在农作物等植物中的应用还比较受限,且其脱... 近年来,CRISPR/Cas9系统经过一系列改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,目前,该技术已成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,但是该技术在农作物等植物中的应用还比较受限,且其脱靶效应等问题还有待解决。本文首先简要综述了CRISPR/Cas9系统的发展历程、结构组成和作用机制及其在农作物中的应用,进而综述了近年来探索出的提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率的方法。最后,对基因组编辑技术在农作物和作物育种上的应用进行了展望。 展开更多
关键词 crispr/cas9系统 向导RNA 脱靶效应 农作物
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在丝状真菌中的应用 被引量：2
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作者 丁宁 卢萍 《绿色科技》 2024年第8期255-264,共10页
丝状真菌次级代谢产物种类繁多,其中许多具重要生物活性物质和药用成分,也有一些具毒素,开展其基因编辑的研究非常有必要,利用该系统可对其基因组进行点突变、插入或缺失,实现基因的敲除,但丝状真菌细胞壁厚且成分复杂,导入外源基因较难... 丝状真菌次级代谢产物种类繁多,其中许多具重要生物活性物质和药用成分,也有一些具毒素,开展其基因编辑的研究非常有必要,利用该系统可对其基因组进行点突变、插入或缺失,实现基因的敲除,但丝状真菌细胞壁厚且成分复杂,导入外源基因较难,开发出高效的CRISPR/Cas9基因组编辑技术极为重要。运用文献研究法,介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的原理、方法及其在丝状真菌中的研究和应用,分析了CRISPR/Cas9系统各组分和呈递体系的优化对丝状真菌中基因编辑效率的影响,其中,Cas9核酸酶、sgRNA表达的优化,启动子、PAM序列及基因组编辑体系的改进都有效地提高了CRISPR/Cas9系统的编辑效率。今后可通过开发无PAM序列要求、可进行基因转录调控、能定向插入和敲除超长目的片段等系列真菌通用的基因编辑体系,实现真菌资源在工业、农业和医药等领域的充分应用。 展开更多
关键词 丝状真菌 crispr/cas9系统 基因组编辑
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