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构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究
被引量：
1
1
作者
赵艳娜
邱荣
+1 位作者
沈南
唐元家
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期297-301,共5页
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-...
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。
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关键词
诱导型
CRISPR/Cas9系统
Dox
诱导型
sgRNA
表达
载体
造血干细胞
基因编辑
巨噬细胞
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职称材料
乳酸乳球菌高效电转化方法的建立
被引量：
8
2
作者
任大勇
李昌
+5 位作者
秦艳青
杜寿文
郭欢欢
刘宏锋
洛阳
金宁一
《中国兽药杂志》
2012年第1期5-9,共5页
以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影...
以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Ω、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2 mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉冲时间分别为10 kV/cm和5 ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2 h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×104 CFU/μg DNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。
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关键词
乳酸乳球菌
电转化
转化效率
感受态细胞
诱导型表达载体
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职称材料
题名
构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究
被引量：
1
1
作者
赵艳娜
邱荣
沈南
唐元家
机构
上海交通大学医学院附属仁济医院风湿病科
中国科学院上海营养与健康研究所
出处
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期297-301,共5页
基金
国家自然科学基金(81871287,31630021)
上海交通大学医学院高水平地方高校创新团队(SSMU-ZDCX20180100)。
文摘
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。
关键词
诱导型
CRISPR/Cas9系统
Dox
诱导型
sgRNA
表达
载体
造血干细胞
基因编辑
巨噬细胞
Keywords
inducible CRISPR/Cas9 system
Dox-inducible sgRNA expression vector
hematopoietic stem cell
gene editing
macrophage
分类号
R394.4 [医药卫生—医学遗传学]
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职称材料
题名
乳酸乳球菌高效电转化方法的建立
被引量：
8
2
作者
任大勇
李昌
秦艳青
杜寿文
郭欢欢
刘宏锋
洛阳
金宁一
机构
吉林农业大学食品科学与工程学院
军事医学科学院军事兽医研究所
吉林大学畜牧兽医学院
出处
《中国兽药杂志》
2012年第1期5-9,共5页
基金
国家自然科学基金(81001342)
吉林省自然科学基金项目(201015116)
+1 种基金
吉林省高新技术产业发展项目(2010)
长春市科技特派员行动计划(09KT04)
文摘
以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactis NZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Ω、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2 mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉冲时间分别为10 kV/cm和5 ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2 h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×104 CFU/μg DNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。
关键词
乳酸乳球菌
电转化
转化效率
感受态细胞
诱导型表达载体
Keywords
Lactococcus lactis
electroporation
electroporation efficiency
competent cells
inducible expression plasmid
分类号
S852.6 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究
赵艳娜
邱荣
沈南
唐元家
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
乳酸乳球菌高效电转化方法的建立
任大勇
李昌
秦艳青
杜寿文
郭欢欢
刘宏锋
洛阳
金宁一
《中国兽药杂志》
2012
8
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职称材料
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引证文献
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