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129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白DELFIA检测方法的建立及初步应用
被引量：
1
1
作者
高歌
查旭
+1 位作者
刘伟进
杨慧
《首都医科大学学报》
CAS
北大核心
2021年第5期776-782,共7页
目的建立解离-增强镧系荧光免疫分析(dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay,DELFIA)检测129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白的方法及初步应用。方法使用体外蛋白重组技术纯化得到人源α-syn蛋白单体(α-syn),用Polo...
目的建立解离-增强镧系荧光免疫分析(dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay,DELFIA)检测129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白的方法及初步应用。方法使用体外蛋白重组技术纯化得到人源α-syn蛋白单体(α-syn),用Polo样激酶催化α-syn获得磷酸化α-syn单体(phosphorylatedα-syn monomer,p-α-syn),用4-氧代壬烯醛制备α-syn聚集体(aggregates ofα-syn,OW)及磷酸化α-syn聚集体(aggregates of p-α-syn,OP)。使用Western blotting法和间接ELISA方法验证本实验室前期制备的识别α-syn蛋白N端的多克隆抗体SN16和识别129位丝氨酸磷酸化α-syn蛋白的单克隆抗体C140S。使用SN16作为捕获抗体,C140S作为检测抗体的双抗夹心DELFIA法建立检测OP的标准曲线,并检测Thy 1-α-SYN转基因小鼠血浆内OP的变化。结果考马斯亮蓝染色和Western blotting法检测结果显示体外纯化的人源α-syn蛋白单体(17000)纯度高,并通过催化获得了p-α-syn、OW和OP纯蛋白,均可用作建立标准曲线的标准抗原。Western blotting和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示SN16对α-syn、p-α-syn、OW、OP这4种形式的蛋白均可识别,C140S可以识别p-α-syn和OP,说明SN16和C140S可以用作双抗夹心法的配对抗体。间接DELFIA检测结果显示C140S对OP的识别效率更好。双抗夹心DELFIA检测结果显示,SN16-C140S作为配对抗体检测标准抗原的范围为:0.625~20 ng/mL,并建立了检测OP的标准曲线。Wt及Tg组小鼠血浆中OP在12月龄均较6月龄有所增加(P<0.001),Tg组6月龄小鼠血浆中OP显著高于同月龄Wt组(P<0.001),Tg组12月龄小鼠血浆OP较Wt组有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论本文建立的SN16-C140S配对的双抗夹心DELFIA体系可以检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆中聚集的磷酸化α-syn变化情况。
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关键词
帕金森病
Α
-
突触核蛋白
磷酸化α
-
突触核蛋白
解离-增强镧系荧光免疫分析
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职称材料
题名
129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白DELFIA检测方法的建立及初步应用
被引量：
1
1
作者
高歌
查旭
刘伟进
杨慧
机构
首都医科大学基础医学院神经生物系
出处
《首都医科大学学报》
CAS
北大核心
2021年第5期776-782,共7页
基金
国家自然科学基金(81870994)
国家重点研发计划(2016YFC1306000)
北京市卫生和计划生育委员会专项(PXM2019-026283-000002)。
文摘
目的建立解离-增强镧系荧光免疫分析(dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay,DELFIA)检测129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白的方法及初步应用。方法使用体外蛋白重组技术纯化得到人源α-syn蛋白单体(α-syn),用Polo样激酶催化α-syn获得磷酸化α-syn单体(phosphorylatedα-syn monomer,p-α-syn),用4-氧代壬烯醛制备α-syn聚集体(aggregates ofα-syn,OW)及磷酸化α-syn聚集体(aggregates of p-α-syn,OP)。使用Western blotting法和间接ELISA方法验证本实验室前期制备的识别α-syn蛋白N端的多克隆抗体SN16和识别129位丝氨酸磷酸化α-syn蛋白的单克隆抗体C140S。使用SN16作为捕获抗体,C140S作为检测抗体的双抗夹心DELFIA法建立检测OP的标准曲线,并检测Thy 1-α-SYN转基因小鼠血浆内OP的变化。结果考马斯亮蓝染色和Western blotting法检测结果显示体外纯化的人源α-syn蛋白单体(17000)纯度高,并通过催化获得了p-α-syn、OW和OP纯蛋白,均可用作建立标准曲线的标准抗原。Western blotting和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示SN16对α-syn、p-α-syn、OW、OP这4种形式的蛋白均可识别,C140S可以识别p-α-syn和OP,说明SN16和C140S可以用作双抗夹心法的配对抗体。间接DELFIA检测结果显示C140S对OP的识别效率更好。双抗夹心DELFIA检测结果显示,SN16-C140S作为配对抗体检测标准抗原的范围为:0.625~20 ng/mL,并建立了检测OP的标准曲线。Wt及Tg组小鼠血浆中OP在12月龄均较6月龄有所增加(P<0.001),Tg组6月龄小鼠血浆中OP显著高于同月龄Wt组(P<0.001),Tg组12月龄小鼠血浆OP较Wt组有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论本文建立的SN16-C140S配对的双抗夹心DELFIA体系可以检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆中聚集的磷酸化α-syn变化情况。
关键词
帕金森病
Α
-
突触核蛋白
磷酸化α
-
突触核蛋白
解离-增强镧系荧光免疫分析
Keywords
Parkinson's disease
α
-
synuclein
phosphorylated α
-
synuclein
dissociation enhanced lanthanide fluorescence immunoassay(DELFIA)
分类号
R742.5 [医药卫生—神经病学与精神病学]
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作者
出处
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1
129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白DELFIA检测方法的建立及初步应用
高歌
查旭
刘伟进
杨慧
《首都医科大学学报》
CAS
北大核心
2021
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