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姜黄素调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对LPS诱导的角膜基质细胞自噬的影响 被引量：2
1
作者 李燕伟 尚利晓 樊冬生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2046-2051,共6页
目的:探讨姜黄素调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对LPS诱导的角膜基质细胞自噬的影响。方法:小鼠角膜基质细胞分为对照组、LPS组(1μg/μl LPS)、L-Cur组(15μmol/L姜黄素)、M... 目的:探讨姜黄素调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对LPS诱导的角膜基质细胞自噬的影响。方法:小鼠角膜基质细胞分为对照组、LPS组(1μg/μl LPS)、L-Cur组(15μmol/L姜黄素)、M-Cur组(30μmol/L姜黄素)、H-Cur组(50μmol/L姜黄素)、H-Cur+740Y-P组(50μmol/L姜黄素+10μmol/L PI3K激活剂740Y-P);MTT检测姜黄素对角膜基质细胞毒性和细胞活力的影响;ELISA检测角膜基质细胞炎症因子水平;免疫荧光染色检测小鼠角膜基质细胞Beclin1、LC3水平;Western blot检测角膜基质细胞自噬相关蛋白及通路相关蛋白表达。结果:0~90μmol/L姜黄素对角膜基质细胞无明显毒性。与对照组相比,LPS组A570nm、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平显著降低(P<0.05),IL-6、IL-8水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,L-Cur组、M-Cur组、H-Cur组A570 nm、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平依次显著升高(P<0.05),IL-6、IL-8水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平依次显著降低(P<0.05);H-Cur+740Y-P消除了姜黄素对角膜基质细胞的有利作用。结论:姜黄素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进LPS诱导的角膜基质细胞自噬。 展开更多
关键词 姜黄素 PI3K/AKT/mTOR信号通路 角膜基质细胞 自噬
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角膜基质细胞诱导分化的脂肪间充质干细胞羊膜片移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效及其机制 被引量：13
2
作者 李颖 杨磊 +3 位作者 宋艳萍 丁琴 陈中山 陈晓 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期500-506,共7页
背景角膜化学烧伤是致盲眼病之一，先前的各种疗法在临床上的应用均受到一定的限制，而脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植疗法受到密切关注。目的观察诱导分化的ADSCs羊膜片移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效及其机制。方法无菌条件下剪取兔角膜... 背景角膜化学烧伤是致盲眼病之一，先前的各种疗法在临床上的应用均受到一定的限制，而脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植疗法受到密切关注。目的观察诱导分化的ADSCs羊膜片移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效及其机制。方法无菌条件下剪取兔角膜，用悬浮基质片法分离并培养兔角膜基质细胞（CSCs）。取兔腹股沟脂肪组织，以酶消化法（质量分数0．25％胰蛋白酶）分离及培养兔ADSCs，并用流式细胞术鉴定ADSCs表面抗原的表达。将CSCs与ADSCs共培养，采用免疫荧光技术和逆转录PCR（RT-PCR）鉴定CSCs诱导后ADSCs向角膜基质样细胞分化的表达，分别将诱导或未诱导的ADSCs种植于羊膜上制备成细胞羊膜片。选择60只新西兰白兔，右眼用浸有质量分数1％NaOH的滤纸贴敷于角膜中央50S制备兔角膜碱烧伤模型，按随机数字表法将模型眼随机分为诱导ADSCs＋羊膜移植组、未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组及模型组。分别于术后1周、2周和1个月在裂隙灯显微镜下观察各组兔模型眼角膜的混浊程度和新生血管形成情况，并对角膜炎症进行评分，采用ELISA法检测术后1个月角膜组织匀浆中CD45、叮干扰素（IFN-γ）、白细胞介素．10（IL-10）蛋白及房水中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的质量浓度。结果从脂肪组织分离培养的ADSCs表面抗原CDl05、CD29、CD44的阳性表达率分别为90．23％、88．56％、98．88％；分离培养的CSCs波形蛋白呈阳性表达；CSCs与ADSCs共培养后多数细胞双标记染色阳性。苏木精一伊红染色显示，ADSCs种植于羊膜后生长良好。术后1个月，模型组角膜混浊呈瓷白色，新生血管面积最大，而诱导ADSCs＋羊膜移植组角膜透明，新生血管最少。术后1个月，诱导ADSCs＋羊膜移植组、未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组兔角膜混浊程度评分分别为1．65±0．18、2．05±0．17、2．68±0．25和2．904-0．18，新生血管面积分别为（10．59±1．78）、（22．58±1．63）、（37．98±1．90）和（45．37±1．65）mm^2，术后1周、2周及1个月4个组间角膜混浊程度评分和角膜新生血管（CNV）面积的差异均有统计学意义（F=280．826、330．172、465．707，均P=0．000；F=60．020、670．811、1510．231，均P=0．000），其中诱导ADSCs＋羊膜移植组角膜炎症评分睨显低于其他3个组，CNV面积小于其他3个组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。术后1个月，4个组间角膜组织匀浆中CD45、IL-10、IFN-γ质量浓度的差异均有统计学意义（F=916．545、1739．358、462．134，均P=0．000），其中与未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组比较，诱导ADSCs＋羊膜移植组CD45、IFN-γ质量浓度明显降低，而IL-10质量浓度明显升高，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。4个组兔房水中VEGF质量浓度的总体比较差异有统计学意义（F=129．126，P=0．000），其中诱导ADSCs＋羊膜移植组兔房水中VEGF质量浓度明显低于未诱导ADSCs＋羊膜移植组、单纯羊膜移植组和模型组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论CSCs诱导的ADSCs羊膜片移植法治疗兔角膜碱烧伤有较好的疗效，其作用机制可能是ADSCs在CECs诱导下分化为具有角膜上皮细胞特征的细胞，同时羊膜可减轻免疫炎症反应，抑制新生血管形成。 展开更多
关键词 脂肪间充质干细胞 移植 羊膜 眼碱烧伤 分化 角膜基质细胞
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牛角膜基质细胞的两步酶消化法高效分离及体外培养观察 被引量：6
3
作者 李杰 李霞 +3 位作者 谭少健 黄宝宇 周卫为 陈迎迎 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期398-401,共4页
背景高效、低成本分离出生物学功能活性高的角膜基质细胞是开展角膜基础研究的需要。目前的分离方法成本高、分离效率低，而通过培养达到扩增细胞数会导致细胞表型快速改变。应用成本较低的Ⅰ型胶原酶，通过改良的两步酶消化法可能达到... 背景高效、低成本分离出生物学功能活性高的角膜基质细胞是开展角膜基础研究的需要。目前的分离方法成本高、分离效率低，而通过培养达到扩增细胞数会导致细胞表型快速改变。应用成本较低的Ⅰ型胶原酶，通过改良的两步酶消化法可能达到高效、快速、低成本分离牛角膜原代基质细胞的目的。目的评价设计的Ⅰ型胶原酶两步酶消化法分离原代牛角膜基质细胞的效果，并观察体外培养原代牛角膜基质细胞的形态学变化。方法分别用基础培养液配制的0．5g／L及1．0g／L Ⅰ型胶原酶以两步酶消化法顺序消化牛角膜组织，分离角膜基质细胞，以细胞计数板进行计数，检测基质细胞收获效率；锥虫蓝染色法检测收获细胞的存活率；分离的细胞进行原代培养，倒置显微镜下观察细胞形态和生长的变化；应用Alexa488标记的鬼笔环肽检测原代培养的牛角膜基质细胞中F—actin的分布。结果牛角膜经两步酶消化法基质逐步解离和降解，绝大多数细胞得以释放和分离，分离的牛角膜基质细胞呈圆形，透亮且大小均匀。每个角膜收获（2．109±0．142）×10。个基质细胞，细胞存活率（91．693±3．551）％，贴壁率（81．195±1．214）％。原代培养的牛角膜基质细胞贴壁呈树突样，铺伸至星状，融合时树突连接呈网状，其F—aetin局限性分布于细胞皮质。结论两步酶消化法可使牛角膜基质完全消化降解，具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作简便等特点。原代培养的牛角膜基质细胞呈树突状，F—actin分布于细胞皮质。 展开更多
关键词 牛 角膜基质细胞 细胞分离 细胞培养
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正常角膜基质细胞密度和角膜厚度的研究 被引量：10
4
作者 罗丽辉 刘祖国 +4 位作者 陈家祺 肖启国 张梅 陈龙山 蒋爱华 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2004年第5期512-515,共4页
目的　观察Confoscan 2 0共焦显微镜下正常活体角膜影像表现 ,测量基质细胞密度与各层厚度。方法　检查 3 4例 ( 4 8眼 )正常人。记录图像 ,并计算基质细胞密度和各层厚度。结果　基质细胞密度从前到后逐渐降低 ,前基质比后基质细胞密... 目的　观察Confoscan 2 0共焦显微镜下正常活体角膜影像表现 ,测量基质细胞密度与各层厚度。方法　检查 3 4例 ( 4 8眼 )正常人。记录图像 ,并计算基质细胞密度和各层厚度。结果　基质细胞密度从前到后逐渐降低 ,前基质比后基质细胞密度明显增高 (t =-9 0 16,P =0 0 0 0 ) ,Bowman膜下密度最高 ,为 ( 1113 2± 2 2 7)个 /mm2 。全基质细胞密度为 ( 80 6 5± 5 7)个 /mm2 。角膜中央厚度为 ( 5 68 3± 5 3 8) μm ,基质层为 ( 4 65 5± 60 2 ) μm ,上皮层为 ( 5 8 5± 2 0 4) μm。各层厚度均与全基质细胞密度无显著相关性 (P >0 0 5 )。结论　Confoscan 2 展开更多
关键词 角膜基质细胞密度 角膜厚度 共焦显微镜 角膜细胞
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壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞相容性的影响 被引量：8
5
作者 姚子昂 韩宝芹 +1 位作者 吴海歌 刘万顺 《中国生物医学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第4期477-481,共5页
以脱乙酰度为95%,相对分子量分别为130KDa、220KDa、300KDa和500KDa的壳聚糖制备不同的壳聚糖膜。以各种壳聚糖膜作为基质,体外培养兔角膜基质细胞,通过观察角膜基质细胞在不同壳聚糖膜上的生长状态、贴附情况、生长曲线以及乳酸脱氢酶... 以脱乙酰度为95%,相对分子量分别为130KDa、220KDa、300KDa和500KDa的壳聚糖制备不同的壳聚糖膜。以各种壳聚糖膜作为基质,体外培养兔角膜基质细胞,通过观察角膜基质细胞在不同壳聚糖膜上的生长状态、贴附情况、生长曲线以及乳酸脱氢酶的活性,研究壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞生物相容性的影响。实验结果表明壳聚糖相对分子量对壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性具有重要的影响,相对分子量过高或过低的情况下,壳聚糖膜与角膜基质细胞相容性较差,对细胞损伤程度较大,细胞在膜上的贴附、生长能力较差;以相对分子量在200KDa～300KDa之间的壳聚糖制备出的膜与角膜细胞具有较好的相容性,细胞可在膜上长成密集单层,适合作为角膜培养的支架材料。 展开更多
关键词 壳聚糖膜 生物相容性 角膜基质细胞
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肿瘤坏死因子-α对兔角膜基质细胞胶原降解代谢的影响 被引量：6
6
作者 郝继龙 谷树严 +2 位作者 尹正玉 刘伯明 贾卉 《白求恩医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期629-630,共2页
目的 :观察肿瘤坏死因子 - α(TNF- α)对角膜基质细胞胶原降解作用的影响。方法 :角膜基质细胞三维胶原凝胶表面分别添加含纤溶酶原及不同浓度 TNF- α的 MEM液 ,培养 2 4 h,测定培养液中羟脯氨酸的量做为胶原降解活性。结果 :TNF- α... 目的 :观察肿瘤坏死因子 - α(TNF- α)对角膜基质细胞胶原降解作用的影响。方法 :角膜基质细胞三维胶原凝胶表面分别添加含纤溶酶原及不同浓度 TNF- α的 MEM液 ,培养 2 4 h,测定培养液中羟脯氨酸的量做为胶原降解活性。结果 :TNF- α以剂量依赖关系增加角膜基质细胞胶原降解。结论 :TNF-α促进角膜基质细胞胶原降解 ,TNF- 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 角膜基质细胞 胶原降解
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ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用 被引量：5
7
作者 高丽昌 李婷婷 +4 位作者 李富勇 唐禄 李海燕 王晓杰 李校堃 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1405-1408,共4页
目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western b... 目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。 展开更多
关键词 角质细胞生长因子-2 ERK1/2 PERK1/2 信号通路 角膜基质细胞 细胞增殖
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兔角膜基质细胞在壳聚糖胶原共混膜体外培养研究 被引量：9
8
作者 丁勇 徐锦堂 +2 位作者 陈建苏 吴春云 陈瑞 《眼科新进展》 CAS 2004年第2期88-90,共3页
目的　探讨壳聚糖 胶原共混膜作为载体体外培养兔角膜基质细胞的可行性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层 ,然后刮去上皮、内皮、前弹力层和后弹力层 ,将剩余的基质层剪碎消化 ,接种在壳聚糖 胶原共混膜上 ,通过间接免疫荧光细胞化学... 目的　探讨壳聚糖 胶原共混膜作为载体体外培养兔角膜基质细胞的可行性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层 ,然后刮去上皮、内皮、前弹力层和后弹力层 ,将剩余的基质层剪碎消化 ,接种在壳聚糖 胶原共混膜上 ,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养的细胞进行鉴别。结果　角膜基质细胞应用消化培养法 4h后部分基质细胞与壳聚糖 胶原共混膜有贴壁现象出现 ,细胞呈梭形。培养 2 4h后 ,基质细胞呈纺锤形且透明 ,此后细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸 ,培养第 6天细胞已经达到完全融合状态 ,呈梭形 ,排列比较整齐。在 6d左右达到 10 0 %融合状态 ,间接免疫荧光细胞化学染色、Vim染色、胞浆染色阳性。结论　传代的细胞具有角膜基质细胞的生物特性 ,壳聚糖 展开更多
关键词 壳聚糖-胶原共混膜 兔角膜基质细胞 体外培养 载体
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角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用 被引量：5
9
作者 边江 曲明俐 +3 位作者 王瑶 杨玲玲 史伟云 周庆军 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期109-114,共6页
背景 氧化应激在圆锥角膜发病过程中具有重要的作用,核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）信号通路是介导细胞氧化应激反应的关键通路,但其在圆锥角膜发病中的作用及其机制鲜见报道. 目的 研究正常角膜与圆锥角膜基质细胞中Nrf... 背景 氧化应激在圆锥角膜发病过程中具有重要的作用,核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）信号通路是介导细胞氧化应激反应的关键通路,但其在圆锥角膜发病中的作用及其机制鲜见报道. 目的 研究正常角膜与圆锥角膜基质细胞中Nrf2-ARE信号通路活化的区别及Nrf2-ARE通路对角膜基质降解酶表达水平的影响,探讨圆锥角膜发病的具体机制.方法 于2012年11月至2013年6月在青岛眼科医院收集圆锥角膜患者术中的角膜组织样本和正常供体角膜样本,采用中性蛋白酶和胶原蛋白酶联合消化法分离角膜基质细胞并用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞80％融合后在培养基中加入200 μmol/L H2O2处理1h以模拟氧化应激微环境.采用DCFH-DA荧光底物孵育法检测细胞内活性氧簇（ROS）含量,分别采用Western blot和实时定量PCR法检测细胞核内Nrf2mRNA及其蛋白、Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA受体（uPAR） mRNA及其蛋白的相对表达水平,采用明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性.结果 正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强于正常角膜基质细胞,细胞核内Nrf2蛋白表达水平均明显高于正常角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=18.155,P＜0.01）,但在H2O2处理条件下,圆锥角膜基质细胞中ROS荧光强度明显强于正常角膜基质细胞,且圆锥角膜基质细胞核内Nrf2表达水平明显低于正常培养条件下的圆锥角膜基质细胞,差异有统计学意义（t=62.123,P＜0.01）.正常培养条件下,圆锥角膜基质细胞间还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原酶1（NQO-1）、血红素氧合酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2） mRNA及其蛋白的相对表达量明显低于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;但在H2O2培养条件下2种细胞间未见明显变化（NQO-1：t=2.209,P=0.092;HO-1：t=0.293,P=0.784;SOD2：t=0.749,P=0.495）;圆锥角膜基质细胞uPA、uPAR表达量和MMP-2活性均明显高于正常角膜基质细胞,差异均有统计学意义（t=19.164、15.458、4.818,均P＜0.01）. 结论 圆锥角膜基质细胞在Nrf2-ARE信号通路活化方面存在缺陷,且这种缺陷与其表达基质降解酶的水平密切相关,说明该通路异常可能是圆锥角膜发病的机制之一. 展开更多
关键词 圆锥角膜 核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件信号通路 角膜基质细胞 氧化应激
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自体血小板血浆对角膜基质细胞生物学功能的影响 被引量：5
10
作者 戴静 陈建苏 +2 位作者 李晓霞 田振彩 赵秀丽 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2010年第8期705-708,713,共5页
目的观察自体血小板血浆对体外培养的角膜基质细胞生物学功能的影响。方法采用二次离心法分离兔全血获得富血小板血浆（platelet—richplasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet—poorplasma，PPP）；原代培养兔角膜基质细胞，取第3代细... 目的观察自体血小板血浆对体外培养的角膜基质细胞生物学功能的影响。方法采用二次离心法分离兔全血获得富血小板血浆（platelet—richplasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet—poorplasma，PPP）；原代培养兔角膜基质细胞，取第3代细胞用于实验。在角膜基质细胞中分别加入体积分数5．0％的PRP和PPP，倒置显微镜下观察细胞生长情况，对比PRP和PPP对角膜基质细胞的促生长情况，以确定自体血小板血浆中促增殖作用的最有效成分。采用不同浓度的PRP（体积分数分别为2．5％、5．0％、10．0％）作用于角膜基质细胞，以及采用不同浓度PRP（体积分数分别为2．5％、5．0％、20．0％）联合FBS作用于角膜基质细胞，CCK-8法检测PRP、PRP联合FBS促进角膜基质细胞增殖的作用。对不同浓度（体积分数分别为2．5％、5．0％）PRP作用的角膜基质细胞进行免疫荧光法检测其表达的平滑肌型肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）．结果加入体积分数5．0％PRP组促细胞增殖作用强于加入体积分数5．0％PPP组。PRP在体积分数为2．5％～10．0％时，均能促进角膜基质细胞的增殖，其中体积分数为5．0％时作用最强；体积分数5．0％PRP与FBS联合作用时的吸光度值随时间的变化均明显高于两者单独作用时的吸光度值（均为P〈0．05），而体积分数20．0％的PRP与FBS联合作用时的吸光度值随时间的变化低于FBS单独作用时的吸光度值。不同浓度PRP处理的角膜基质细胞均可见a-SMA的阳性表达。结论低浓度的PRP能有效促进角膜基质细胞的增殖及活化，有利于角膜基质损伤的快速修复，促进伤口愈合，防止严重并发症的发生。 展开更多
关键词 自体血小板血浆 富血小板血浆 贫血小板血浆 角膜基质细胞 兔
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转化生长因子-β1介导的角膜基质细胞外基质纤维化体外三维培养模型的构建 被引量：4
11
作者 靳荷 罗世男 +3 位作者 范梓晰 李杰 周卫为 李霞 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期406-411,共6页
背景 角膜损伤修复过程中细胞外基质（ECM）纤维化是角膜瘢痕形成的基础,转化生长因子-β1（TGF-β1）可引起角膜基质过度产生ECM.我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型,而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建... 背景 角膜损伤修复过程中细胞外基质（ECM）纤维化是角膜瘢痕形成的基础,转化生长因子-β1（TGF-β1）可引起角膜基质过度产生ECM.我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型,而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建角膜基质ECM纤维化的体外三维培养模型有待研究.目的 评估TGF-β1对该三维培养模型中ECM纤维化相关基因表达的影响,确定该三维培养体系是否可以作为角膜基质ECM纤维化的体外三维培养候选模型.方法分离新鲜成年牛角膜,并在基础培养液（DMEM/F12＋体积分数10％胎牛血清）中进行角膜基质细胞的培养,将5＆#215;105个牛角膜基质细胞收集于15 ml离心管中构建体外三维培养模型（Pellet）,根据培养液中添加的TGF-β1质量浓度的不同分为基础培养液组（无TGF-β1）、基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组,于培养2周时用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法（Calcein-AM/PI）法进行细胞活性测定;分别于培养后48 h、1周和2周应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和Western blot法检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）、ColⅢmRNA及其蛋白的表达. 结果 Pellet模型培养后48 h,角膜基质细胞开始抱团,培养后2周经Calcein AM/PI染色证实绝大多数细胞存活.培养后48 h、1周和2周,基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组角膜基质细胞中α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量均明显高于基础培养液组,3个组间的总体差异均有统计学意义（F分组=696.745,P＜0.001;F分组=35.166,P＜0.001;F分组=33.677,P＜0.001）,且随着培养时间的延长,α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量逐渐升高,差异均有统计学意义（F时间=5.863,P＜0.05;F时间=298.614,P＜0.001;F时间=607.472,P＜0.001）;ColⅢmRNA合成速率均大于Col Ⅰ mRNA的合成速率;Western blot检测发现,培养后48 h和1周α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的表达量为微量,培养后2周基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组Pellet模型中α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的相对灰度表达量分别为0.395±0.208、1.060±0.175和0.629±0.382,基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组o-SMA、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白的灰度表达量分别为0.758±0.228、1.201±0.187和0.753 ±0.468,组间总体比较差异均有统计学意义（α-SMA：F=10.691,P＜0.05;Col Ⅰ：F=14.094,P＜0.05;ColⅢ：F=10.995,P＜0.05）. 结论 培养液中添加TGF-β1和血清促进角膜ECM的纤维化,表现为Pellet三维培养模型中牛角膜基质细胞高表达纤维化特异性标志物.该培养体系可作为角膜基质ECM纤维化研究的体外三维培养模型. 展开更多
关键词 角膜基质细胞 创伤修复 细胞培养技术/方法 转化生长因子-Β1 细胞外基质 纤维化 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原
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绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用 被引量：3
12
作者 郝继龙 王菲 +2 位作者 周鸿雁 赵文霞 谷树严 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期488-490,共3页
目的:探讨绿脓杆菌外毒素A兔对角膜基质细胞的毒性作用。方法:含兔角膜基质细胞(1×105.mL-1)三维胶原凝胶表面添加提纯的不同浓度绿脓杆菌外毒素A(0.1、1.0和10 mg.L-1)后,放入无血清MEM培养液中37℃培养24 h,采用光学显微镜观察... 目的:探讨绿脓杆菌外毒素A兔对角膜基质细胞的毒性作用。方法:含兔角膜基质细胞(1×105.mL-1)三维胶原凝胶表面添加提纯的不同浓度绿脓杆菌外毒素A(0.1、1.0和10 mg.L-1)后,放入无血清MEM培养液中37℃培养24 h,采用光学显微镜观察培养的兔角膜基质细胞形态学变化,采用酶联免疫吸附法检测损伤的兔角膜基质细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A(0.1、1.0和10 mg.L-1)各组兔角膜基质细胞释放的LDH,与不添加绿脓杆菌外毒素A组比较,差异均有显著性(P<0.01)。添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A各组较不添加绿脓杆菌外毒素A组,角膜基质细胞形态发生变化,细胞由长纺锤形变为圆形,细胞伪足减少。结论:绿脓杆菌外毒素A,破坏角膜基质细胞,对兔角膜基质细胞毒性作用有剂量依赖性。 展开更多
关键词 假单胞菌 铜绿 角膜基质细胞 外毒素类 乳酸脱氢酶
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角膜基质细胞-PGA生物支架复合物体外培养研究 被引量：7
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作者 胡晓洁 商庆新 曹谊林 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2001年第4期308-311,共4页
目的　　研究角膜基质细胞与ＰＧＡ亲和力，为组织工程技术构建角膜提供重要的理论依据和参数。方法体外分离获得角膜基质细胞，经培养扩增后接种于ＰＧＡ，并对细胞－生物材料复合物进行体外培养，观察细胞生长代谢。应用ＭＴＴ技术测... 目的　　研究角膜基质细胞与ＰＧＡ亲和力，为组织工程技术构建角膜提供重要的理论依据和参数。方法体外分离获得角膜基质细胞，经培养扩增后接种于ＰＧＡ，并对细胞－生物材料复合物进行体外培养，观察细胞生长代谢。应用ＭＴＴ技术测定角膜基质细胞与ＰＧＡ的黏附率。结果　角膜基质细胞能够在ＰＧＡ中黏附、伸展和分泌基质，ＭＴＴ测得细胞黏附率为 ７１．４０％。结论　　角膜基质细胞与 ＰＧＡ具有较好的亲和力，ＰＧＡ可以作为构建角膜的生物材料。 展开更多
关键词 组织工程 角膜基质细胞 生物支架 聚羟基乙酸 角膜疾病 实验研究
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吡非尼酮抑制转化生长因子β1诱导的大鼠角膜基质细胞纤维化 被引量：4
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作者 吴共发 邱丽浈 +3 位作者 黄绮亭 刘钰君 曾宇婷 陈俊杰 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第12期1955-1958,共4页
目的观察吡非尼酮(PFD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨PFD抗角膜基质纤维化的作用。方法分离培养大鼠角膜基质细胞,免疫细胞化学法检测波形蛋白(Vimentin)进行细胞鉴定。实验分为对... 目的观察吡非尼酮(PFD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨PFD抗角膜基质纤维化的作用。方法分离培养大鼠角膜基质细胞,免疫细胞化学法检测波形蛋白(Vimentin)进行细胞鉴定。实验分为对照组(DMEM+10%FBS)、TGF-β1组(2 ng/mL TGF-β1+DMEM+10%FBS)和PFD组(1 mg/mL PFD+2 ng/mL TGF-β1+DMEM+10%FBS)。CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白表达。结果大鼠角膜基质细胞呈Vimentin胞浆阳性。与对照组及TGF-β1组比较,PFD组细胞的增殖OD值显著减低(P<0.05)。Western blot显示PFD组的细胞CollagenⅠ、Keratocan蛋白表达增强而CollagenⅢ和CD90蛋白表达减弱(P<0.05)。PFD组的CollagenⅢ/CollagenⅠ比值在3组中最低(P<0.05)。结论 PFD抗角膜基质细胞纤维化是通过抑制TGF-β分子途径,从而影响胶原合成和Keratocan、CD90蛋白表达实现的。 展开更多
关键词 吡非尼酮 角膜基质细胞 转化生长因子Β1 纤维化
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胶原-壳聚糖和角膜基质细胞复合膜的构建及其生物相容性 被引量：3
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作者 贾卉 王娇 +2 位作者 胡源 张媛 张冰 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期440-443,579,共5页
目的:探讨以胶原-壳聚糖为生物支架构建角膜基质细胞复合膜及其生物相容性。方法:兔和人角膜基质细胞分离培养后种植到胶原-壳聚糖共混膜上,构建成复合膜后移植到异体大耳白兔角膜基质囊袋中,术后1、2和4周时分别于活体进行前节OCT、Cs-... 目的:探讨以胶原-壳聚糖为生物支架构建角膜基质细胞复合膜及其生物相容性。方法:兔和人角膜基质细胞分离培养后种植到胶原-壳聚糖共混膜上,构建成复合膜后移植到异体大耳白兔角膜基质囊袋中,术后1、2和4周时分别于活体进行前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化检测,观察复合膜中角膜基质细胞生长状态、生物支架对正常角膜细胞的影响及生物膜的降解情况。结果:活体前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化观察结果显示,兔和人角膜基质细胞在胶原-壳聚糖共混膜上生长良好,移植后复合膜逐渐发生降解,角膜组织未发生坏死和溶解,角膜上皮、基质和内皮细胞形态结构正常。结论:胶原-壳聚糖可作为角膜基质构建的生物支架,角膜共焦显微镜及前节OCT作为新的手段可活体观察构建后的角膜基质生物学活性。 展开更多
关键词 角膜基质细胞 胶原-壳聚糖 组织工程
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兔房水HPCE检测及其对培养角膜基质细胞的作用 被引量：2
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作者 陈建苏 李晓霞 +6 位作者 唐光霞 麦志伟 王升威 洪嘉凡 罗子源 李泽键 卢春婷 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期374-377,共4页
目的:采用高效毛细管电泳(HPCE)的毛细管区带电泳(CZE)分离与检测兔房水中各蛋白组成,观察房水对培养角膜基质细胞的作用。方法:CZE测定新西兰白兔房水蛋白成分:运行缓冲液硼酸钠-硼酸缓冲溶液(pH=8.7、9.1、9.4);毛细管柱温20℃;检测波... 目的:采用高效毛细管电泳(HPCE)的毛细管区带电泳(CZE)分离与检测兔房水中各蛋白组成,观察房水对培养角膜基质细胞的作用。方法:CZE测定新西兰白兔房水蛋白成分:运行缓冲液硼酸钠-硼酸缓冲溶液(pH=8.7、9.1、9.4);毛细管柱温20℃;检测波长200 nm;压力进样0.5 psi,进样时间10s;运行电压20 kV。第1代培养角膜基质细胞进行DMEM/F12培养,加入体积分数为10%的房水,CCK-8检测24 h后细胞增殖情况,每天倒置显微镜下观察细胞生长情况。结果:应用pH=9.4的硼酸钠-硼酸缓冲溶液可获得分离效果较理想的兔房水毛细管电泳峰图。加入房水24 h后CCK8检测吸光度增高(P<0.05),角膜基质细胞生长良好。结论:HPCE可快速有效方便检测兔房水蛋白成分,体积分数为10%的兔房水可促进培养的兔角膜基质细胞生长与增殖。 展开更多
关键词 房水 高效毛细管电泳(HPCE) 毛细管区带电泳(CZE) 角膜基质细胞 分离
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壳聚糖-透明质酸共混膜对兔角膜基质细胞生长的影响 被引量：3
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作者 吴海歌 姚子昂 +4 位作者 刘媛媛 囤景鑫 于超 史丽颖 冯宝民 《中国生物医学工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期581-585,共5页
观察各种壳聚糖-透明质酸共混膜对角膜基质细胞生长的影响作用,研究透明质酸混入比例对共混膜与细胞相容性的影响。以共混膜为载体培养兔角膜基质细胞,通过光学和电子显微镜,观察细胞在膜上的生长情况;通过MTT法,检测细胞在共混膜上的... 观察各种壳聚糖-透明质酸共混膜对角膜基质细胞生长的影响作用,研究透明质酸混入比例对共混膜与细胞相容性的影响。以共混膜为载体培养兔角膜基质细胞,通过光学和电子显微镜,观察细胞在膜上的生长情况;通过MTT法,检测细胞在共混膜上的贴附率和生长活性;通过检测培养基中乳酸脱氢酶的活性,预示壳聚糖-透明质酸共混膜与角膜基质细胞的相容性。以低于1∶0.1的比例混入透明质酸,可以提高细胞在共混膜上的贴附率、生长速度,细胞在共混膜上的生长状态好于在壳聚糖膜上的生长状态。结果提示,以低于1∶0.1的比例混入透明质酸,可以提高壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性,促进细胞生长;而以高于1∶0.1的比例混入透明质酸,则不利于细胞在共混膜上的生长,降低了壳聚糖膜与角膜基质细胞的相容性。 展开更多
关键词 壳聚糖-透明质酸共混膜 角膜基质细胞 相容性
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茄病镰刀菌对体外培养小鼠角膜基质细胞TLR4表达的影响 被引量：3
18
作者 黄礼彬 韩晓丽 +1 位作者 胡建章 徐国兴 《眼科研究》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期747-750,共4页
目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(TLR4)的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液(孢子密度为1×106CFU/mL)来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0 h... 目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(TLR4)的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液(孢子密度为1×106CFU/mL)来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0 h(即未刺激)以及3、6、12 h后应用免疫细胞化学染色、RT-PCR法测定各组细胞TLR4蛋白及mRNA的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。结果培养的角膜基质细胞1周后融合,波形蛋白荧光染色阳性。TLR4蛋白及mRNA在未刺激角膜基质细胞呈微弱表达,3 h较前明显升高,6 h达到高峰,12 h开始减弱,但与0 h相比,差异均有统计学意义(蛋白:t3 h=0.031,t6 h=0.097,t12 h=0.069,P<0.05;mRNA:t3 h=0.367,t6 h=0.422,t12 h=0.078,P<0.05)。TNF-α分泌量随着刺激时间的延长呈上升趋势,6 h达到高峰,然后逐渐下降,3、6、12 h组与0 h组比较差异均有统计学意义(t3 h=21.152,t6 h=40.854,t12 h=27.713,P<0.05)。TLR4mRNA及蛋白的表达与TNF-α的分泌间均呈正相关(r=0.729,0.751,P<0.05)。结论TLR4可能在角膜识别真菌感染、介导炎性防御反应过程中起到重要的作用。 展开更多
关键词 TLR4 角膜基质细胞 茄病镰刀菌 真菌性角膜炎
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兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性 被引量：3
19
作者 霍霄鲲 原林 +4 位作者 黄涛 余磊 戴景兴 秦建强 夏虎 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第7期624-625,636,共3页
目的改进兔角膜基质细胞培养技术,观察其生物学特性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层,然后刮去上皮、内皮、前弹力和后弹力层,接着将剩余的基质层剪碎消化、接种,采用MTT法观察细胞生长情况,并对比有、无血清培养基对细胞生长的影响... 目的改进兔角膜基质细胞培养技术,观察其生物学特性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层,然后刮去上皮、内皮、前弹力和后弹力层,接着将剩余的基质层剪碎消化、接种,采用MTT法观察细胞生长情况,并对比有、无血清培养基对细胞生长的影响。结果　角膜基质细胞10d后形成细胞单层,增殖旺盛。有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰,无血清培养基培养的细胞生长较慢,第9天左右达到生长高峰。结论　改进的角膜细胞培养技术简便、成功率高,培养出的角膜基质细胞生长良好。血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。 展开更多
关键词 角膜损伤 组织工程学 角膜基质细胞 体外培养 生物学特性
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Bcl-xl/Lipofectamine^(TM)2000比值对人角膜基质细胞转染效率的影响 被引量：5
20
作者 李新宇 李贵刚 朱雪菲 《眼科新进展》 CAS 2006年第7期524-526,共3页
目的检测Bclxl/LipofectamineTM2000复合物中两者比值对转染人角膜基质细胞转染效率的影响,探讨其用于人角膜基质细胞基因转染的最佳比值。方法选择Bclxl/LipofectamineTM2000比值1∶2、1∶4、1∶8、1∶10四个实验组制备载体复合物转染... 目的检测Bclxl/LipofectamineTM2000复合物中两者比值对转染人角膜基质细胞转染效率的影响,探讨其用于人角膜基质细胞基因转染的最佳比值。方法选择Bclxl/LipofectamineTM2000比值1∶2、1∶4、1∶8、1∶10四个实验组制备载体复合物转染人角膜基质细胞,转染时间24h。在转染后3d,采用半定量RTPCR检测目的基因Bclx1mRNA表达的变化;采用免疫组织化学染色法及流式细胞计数法检测目的基因Bclx1表达阳性细胞率。数据采用SPSS软件分析。结果Bclxl/LipofectamineTM2000载体复合物中两者比值能显著影响其对人角膜基质细胞的转染效率,存在最佳的比值。当Bclxl/LipofectamineTM2000比值为1∶8时,培养的人角膜基质细胞获得了最佳的转染效率。转染后3d,定量PCR显示1∶8组mRNA表达水平高于其他组(P<0.05),Bclx1免疫组化染色及流式细胞计数法均显示1∶8组转染效率最高,阳性细胞率为(45.6±2.0)%(免疫组织化学染色法),(48.3±3.0)%(流式细胞计数法)(P<0.05)。结论LipofectamineTM2000能有效介导外源基因Bclxl转染人角膜基质细胞。Bclxl/LipofectamineTM2000载体复合物比值为1∶8时转染效率最高。 展开更多
关键词 BCL-XL 角膜基质细胞 基因转染 阳离子脂质体
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