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视黄酸信号通路调控咽弓神经嵴影响斑马鱼牙齿发育的研究
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作者 刘鑫 黄兴 +1 位作者 徐智云 杨德琴 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期115-120,共6页
目的研究视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼颅神经嵴迁移至咽弓神经嵴对牙齿发育的影响。方法将野生型斑马鱼胚胎与转基因斑马鱼胚胎各分为3组,分别采用1×10-7~6×10-7 mol·L-1梯度浓度的RA（RA处理组）、1×10-7 mol... 目的研究视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼颅神经嵴迁移至咽弓神经嵴对牙齿发育的影响。方法将野生型斑马鱼胚胎与转基因斑马鱼胚胎各分为3组,分别采用1×10-7~6×10-7 mol·L-1梯度浓度的RA（RA处理组）、1×10-7 mol·L-1的4-二乙氨基苯甲醛（DEAB）（DEAB处理组）、与RA处理组相应浓度的二甲基亚砜（DMSO对照组）处理24 hpf胚胎9 h。制备dlx2a、barx1、dlx2b基因的反义探针,运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼48~72 hpf胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表达,荧光显微镜观察转基因斑马鱼4 dpf胚胎。结果获得3个基因的反义m RNA探针。与DMSO对照组相比,1×10-7 mol·L-1RA处理组barx1、dlx2a在咽弓神经嵴的表达明显增强,并有由咽弓神经嵴向后段咽弓牙齿萌出位点迁移的趋势,绿色荧光向周边咽弓扩散;4×10-7 mol·L-1 RA处理组胚胎致畸率和死亡率极高,3×10-7 mol·L-1 RA处理组1/3胚胎发育迟缓。DEAB处理组神经嵴发育不良,barx1、dlx2a表达降低,dlx2b在牙齿位点的表达有所延迟。结论 RA能够通过调控咽弓神经嵴发育过程,进而调控牙齿发育前体细胞,最终达到调控牙齿发育的过程。 展开更多
关键词 视黄酸信号通路 牙齿发育 神经嵴 斑马鱼
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双同源盒诱导小鼠胚胎干细胞向胚外内胚层分化的机制研究
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作者 洪磊 郭传亮 +4 位作者 蔡勤 李婉睿 曾溢滔 薛燕 曾凡一 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1359-1369,共11页
目的·探索双同源盒(double homeobox,DUX)蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)向胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)分化潜能的影响及可能的作用机制。方法·使用慢病毒体系在mESC中构建过表达DUX细胞... 目的·探索双同源盒(double homeobox,DUX)蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)向胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)分化潜能的影响及可能的作用机制。方法·使用慢病毒体系在mESC中构建过表达DUX细胞系,利用流式细胞术检测DUX过表达前后2细胞样细胞(2-cell-like cell,2CLC)的比例,并使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测2细胞期特异性基因,如内源性Dux、锌指和SCAN结构域的蛋白质4c(zinc finger and SCAN domain containing 4c,Zscan4c)、锌指蛋白352(zinc finger protein 352,Zfp352)和鼠内源性反转录病毒-聚合酶(murine endogenous retrovirus-L polymerase,MERVL-pol)的表达。RT-qPCR检测过表达DUX的mESC多能性因子[nanog homeobox(Nanog)、kruppel-like transcription factor 4(Klf4)、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,Sox2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)]和自然分化状态下各胚层标志性基因[内胚层(endodermal):GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,Gata4)、Gata6、Sox17;外胚层(ectodermal):微Ⅲ型β微管蛋白3(tubulin beta 3 classⅢ,Tubb3)、巢蛋白(Nestin);中胚层(mesodermal):心脏和神经嵴衍生物表达转录本1(heart and neural crest derivatives expressed 1,Hand1)、肌源性分化蛋白1(myogenic differentiation 1,Myod1)、激酶插入结构域受体(kinase insert domain protein receptor,Flk1)]的表达。挖掘公共转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据,通过分析胚外内胚层标志基因的表达水平,明确DUX对mESC向胚外内胚层分化的影响;通过对差异基因的功能及通路进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),找出DUX作用的信号通路;深入分析已有的染色质免疫共沉淀技术结合二代测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据,探究DUX的潜在靶基因。结果·2CLC比例升高和2细胞期标志基因表达上调,证明已成功构建过表达DUX细胞系。分子生物学实验显示过表达DUX后可有效维持mESC的多能性,与公共RNA-seq数据分析结果一致;差异基因分析发现,内胚层基因出现特异性上调;诱导mESC自然分化后,RT-qPCR检测实验表明XEN标志基因(Gata4、Gata6、Sox17)的mRNA表达出现显著上调(P<0.001),而中胚层、外胚层基因没有特异性变化。GSEA结果提示DUX可能激活了视黄醇代谢信号通路,ChIP-seq数据解析进一步揭示在DUX结合的peaks中存在已知的视黄酸受体motif,可激活下游与XEN发育相关的靶基因。结论·DUX与视黄酸信号通路密切关联,预示其激活了视黄酸信号通路,促进mESC倾向XEN分化。 展开更多
关键词 小鼠胚胎干细胞 胚外内胚层细胞 双同源盒 视黄酸信号通路
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敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用 被引量：5
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作者 许曼 黄立平 +8 位作者 邵玉乐 夏德利 曾为俊 王辉 鲁国涛 刘长明 陈洪岩 王金泉 孟庆文 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期14-21,共8页
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了... 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑 视黄酸诱导基因Ⅰ信号通路 PK-15 猪圆环病毒2型
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