对虾白斑综合症病毒类锌指蛋白基因(wsv063、wsv069和wsv477)的表达和纯化 被引量：4

1

作者 朱艳冰 杨丰 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期697-700,共4页

从对虾白斑综合症病毒基因组的预测开放阅读框中选取3个编码类锌指蛋白的基因wsv063、wsv069和wsv477,将它们克隆到pET-GST表达载体,以E.coliBL21(DE3)为宿主菌,成功表达了GST融合的目的蛋白.表达的GST-WSV063和GST-WSV477在菌体里主要... 从对虾白斑综合症病毒基因组的预测开放阅读框中选取3个编码类锌指蛋白的基因wsv063、wsv069和wsv477,将它们克隆到pET-GST表达载体,以E.coliBL21(DE3)为宿主菌,成功表达了GST融合的目的蛋白.表达的GST-WSV063和GST-WSV477在菌体里主要以包涵体形式存在,GST-WSV069在菌体里可溶性形式和包涵体形式几乎等量存在.采用glutathione sepharose 4B或Ni-NTA agarose亲和层析对目的蛋白进行了纯化.以上3种病毒蛋白的表达和纯化为进一步研究它们的功能奠定了基础. 展开更多

关键词 对虾白斑综合症病毒wsv63 wsv69和wsv477基因 类锌指蛋白 表达和纯化

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HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化

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作者 邵继平 符健 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期579-583,共5页

目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点... 目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化。利用基因工程技术构建野生型pc DNA3. 1-gp41和突变型pc DNA3. 1-Mgp41表达载体。取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析。结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺(Asn)的编码基因(AAU)突变为谷氨酰胺(Gln)的编码基因(GAA),成功构建了野生型和突变型gp41表达载体。琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 k D处出现目的条带,与预期一致。结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础。 展开更多

关键词 HIV-1 病毒 包膜糖蛋白gp41 去糖基化突变体 表达和纯化

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莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

3

作者 胡元森 王远 +3 位作者 吕扬勇 黄亮 张帅兵 李娜 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第2期1-11,共11页

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建... 【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。 展开更多

关键词 莱姆病螺旋体 端粒解离酶 原核表达和纯化 蛋白结晶 X-射线衍射

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HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备 被引量：1

4

作者 杨小昂 钱晓萍 +2 位作者 孙秀媛 邵启祥 陈慰峰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期29-32,共4页

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克... 目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。 展开更多

关键词 蛋白表达和纯化 肿瘤相关抗原 HCA518 单克隆抗体

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FimH重组蛋白的原核表达及纯化 被引量：3

5

作者 刘忠芳 陈林 +3 位作者 殷晓佳 李晓霞 李宇红 孟柳燕 《口腔医学研究》 CAS CSCD 2013年第10期893-896,共4页

目的:在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白。方法:采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重... 目的:在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白。方法:采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,最后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白。结果:成功构建出表达大肠杆菌(K12,BL21)和沙门氏菌(S.T.)FimH的原核表达载体pET28a-K12/BL21/S.T.,经酶切、测序和Western Blot鉴定,目的蛋白表达正确。在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20h,可使FimH的表达量达到最大,分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为一条带。结论:本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异。本研究为后续研究3种蛋白生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础。 展开更多

关键词 FimH 大肠杆菌 沙门氏菌 重组蛋白 表达和纯化

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鸡补体受体2基因克隆、蛋白表达纯化及其多克隆抗体的制备和鉴定 被引量：3

6

作者 孔子萌 江波 +3 位作者 蔡云虹 何后军 李永清 靳换 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第1期201-208,共8页

为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR 2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-... 为初步鉴定鸡补体受体2(ChCR2)基因,本试验设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增ChCR 2基因。利用同源臂连接的方法构建去掉跨膜区的ChCR2-△TM基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM,将两个原核质粒转入大肠杆菌表达系统中表达GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。将纯化后的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠制备血清多克隆抗体,以His-ChCR2-△TM蛋白为包被原,ELISA检测血清多克隆抗体效价。利用间接免疫荧光试验和Western blotting对抗原抗体的特异结合性进行鉴定。结果显示,扩增到了一条大小为1113 bp的ChCR 2基因条带。成功构建了去掉跨膜区的原核表达载体pGEX-6P-1-ChCR2-△TM、pET-32a-ChCR2-△TM和真核表达载体pCMV-HA-ChCR2-△TM。诱导表达的GST-ChCR2-△TM蛋白在低温(16℃)诱导条件下可溶,而His-ChCR2-△TM蛋白以包涵体的形式存在。经ELISA测定,GST-ChCR2-△TM蛋白免疫的BALB/c小鼠血清效价为1∶512000。间接免疫荧光试验和Western blotting结果显示,制备的抗GST-ChCR2-△TM蛋白血清多克隆抗体可与ChCR2蛋白发生特异性结合。本研究结果为ChCR 2基因的进一步鉴定及鸡乃至禽类的相关免疫学研究提供了参考依据。 展开更多

关键词 ChCR2基因 蛋白表达和纯化 多克隆抗体 ELISA 间接免疫荧光 Western BLOTTING

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细胞凋亡检测蛋白AnnexinV的制备纯化和初步评价 被引量：2

7

作者 陈大明 谢虹 +8 位作者 祁本忠 张颖梅 贾兵 杨红伟 罗志福 张锦荣 金小海 王凡 马大龙 《原子能科学技术》 EI CAS CSCD 2004年第z1期182-187,共6页

文章利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达了人重组AnnexinV,建立了批量获得AnnexinV工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序。通过SDS PAGE分析和得到的AnnexinV标记上FITC后能对地塞米松引起Balb/c小鼠胸腺单细胞产生的... 文章利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达了人重组AnnexinV,建立了批量获得AnnexinV工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序。通过SDS PAGE分析和得到的AnnexinV标记上FITC后能对地塞米松引起Balb/c小鼠胸腺单细胞产生的凋亡进行有效检测的实验表明:经过离子层析纯化后得到了高纯度、有生物活性的人重组AnnexinV纯品。细胞结合分析的结果显示:AnnexinV的KD值为8.53nmol/L,RT为8.79nmol/L。 展开更多

关键词 细胞凋亡 ANNEXIN V 诱导表达和纯化 FITG-Annexin V 细胞结合分析

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三种呈味肽串联基因的构建和表达 被引量：3

8

作者 钱玮 李云亮 +1 位作者 何华纲 马海乐 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第14期209-211,215,共4页

通过对呈味肽GD、AD、VD结构的分析,引入甲酸和胰蛋白酶的专一性位点,设计了呈味肽的串联单体。根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成寡核苷酸片段,利用拼接法合成此三种肽的8拷贝片段,将其克隆至表达载体pET-30a并转化到宿主菌BL21(DE3)... 通过对呈味肽GD、AD、VD结构的分析,引入甲酸和胰蛋白酶的专一性位点,设计了呈味肽的串联单体。根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成寡核苷酸片段,利用拼接法合成此三种肽的8拷贝片段,将其克隆至表达载体pET-30a并转化到宿主菌BL21(DE3)中。筛选的阳性克隆经测序表明,本研究已成功构建了重组呈味肽工程菌BL21-pET30-8GD、BL21-pET30-8AD、BL21-pET30-8VD。IPTG诱导的菌体总蛋白和破碎液上清的纯化物经Tricine-SDS-PAGE电泳检测,证明目的基因得以成功表达。 展开更多

关键词 呈味肽 串联基因 工程菌 表达和纯化

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猫传染性腹膜炎病毒N蛋白的原核表达及多抗制备 被引量：6

9

作者 牛铮 徐沙沙 +7 位作者 张静怡 张依玲 阚子斐 张淑娟 邹宏 邹卓岚 冉玲 宋振辉 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1-9,共9页

猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)是冠状病毒中的重要成员,也是引起猫传染性腹膜炎的主要病原.参考GenBank数据库中FIPV核衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以病料组织中提取的RNA为模板,反转录成cDNA,通过PCR特异性扩增N基因序列,将其克隆至pM... 猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)是冠状病毒中的重要成员,也是引起猫传染性腹膜炎的主要病原.参考GenBank数据库中FIPV核衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以病料组织中提取的RNA为模板,反转录成cDNA,通过PCR特异性扩增N基因序列,将其克隆至pMD19-T载体并转化至Trans5α感受态细胞,经筛选、菌液PCR与限制酶双酶切鉴定后,获得重组克隆质粒pMD19-T-N.以pMD19-T-N为模板,亚克隆N基因,将其与Pet-28a载体连接后转化至表达菌株Rosetta感受态细胞,完成Pet-28a-N重组表达质粒的构建.用IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白皮下多点注射免疫比利时兔,制备多克隆抗体.最终通过Western-Blot与免疫组化技术检测多克隆抗体的特异性.FIPV N蛋白多克隆抗体的制备,为猫传染性腹膜炎的进一步研究及临床治疗提供了必备的实验材料. 展开更多

关键词 猫传染性腹膜炎病毒 蛋白表达和纯化 多克隆抗体制备 特异性鉴定

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兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定 被引量：6

10

作者 房青 张明程 +5 位作者 查园园 毕胜利 李志伟 杨建国 小祝修 林晨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期91-94,共4页

目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结... 目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果 :成功地表达并纯化了HSelP ,制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP。结论 :以原核表达并纯化的HSelP为免疫原 ,成功地制备了兔抗该蛋白的抗体 ,Westernblot鉴定特异性良好。为进一步研究硒蛋白P的功能。 展开更多

关键词 人硒蛋白P 蛋白表达和纯化 多克隆抗体

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具生物活性的重组鸡催乳素的制备 被引量：1

11

作者 岳光芳 陈益填 +2 位作者 刘颖 李万利 施振旦 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期69-73,共5页

将鸡催乳素(PRL)成熟肽cDNA片段插入原核表达载体pRSETA的NheI和Hind III位点之间,构建重组表达质粒pPRL-SCAU.将此质粒转化大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21(DE3),将重组菌在含氨苄青霉素的LB培养基中培养,再经IPTG诱导,可以诱导表达... 将鸡催乳素(PRL)成熟肽cDNA片段插入原核表达载体pRSETA的NheI和Hind III位点之间,构建重组表达质粒pPRL-SCAU.将此质粒转化大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21(DE3),将重组菌在含氨苄青霉素的LB培养基中培养,再经IPTG诱导,可以诱导表达相对分子质量约为24 500的重组鸡PRL.经0.1 mmol/L IPTG诱导4 h后,表达量达到最高,占总菌体蛋白的30%左右.表达的重组鸡PRL含组氨酸标记,以包涵体形式存在,可经50%Ni-NTA树脂分离纯化,然后在透析复性后分离出可溶性部分.将此可溶性重组鸡PRL对3月龄的鸽子在左侧嗉囊处相同位置隔24 h2次皮内注射,能够显著促进嗉囊上皮的增生.与天然鸡催乳素的增生效果相比,所表达的重组鸡PRL的生物学活性为天然催乳素的17%至25%. 展开更多

关键词 鸡PRL融合蛋白 表达和纯化 复性 生物活性

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人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：1

12

作者 邓虎平 庄然 +4 位作者 宋朝君 田莹 贾卫 张赟 金伯泉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期356-358,362,共4页

目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠,... 目的：表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体（mAb）, 并且研究CD112的分布.方法：采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术（FCM）检测 CD112 的细胞系分布.结果：构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株（命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9）, 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论：成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础. 展开更多

关键词 CD112(Nectin2、PRR2) 蛋白表达和纯化 MAB

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ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

13

作者 辛清婷 马金芳 +3 位作者 王玮 刘绍辉 李荣秀 朱焕章 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期622-629,共8页

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用... DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,ΦC31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而C末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础. 展开更多

关键词 ΦC31整合酶 截短型突变体 原核表达和纯化 DNA结合能力

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