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纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域
被引量：
6
1
作者
李朝阳
蔡卫斌
+6 位作者
杨中汉
杨霞
宋志宏
周世豪
李明友
刘祖国
高国全
《中国生物化学与分子生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第1期17-23,共7页
根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5mut2(Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型...
根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5mut2(Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板,用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段,定向克隆入pET22b(+)质粒载体,重组体转化进大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖,且活性强度是完整的K5蛋白2倍;K5mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示,完整的Kringle结构(包含3个二硫键)是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域,而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需.
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关键词
纤溶酶原
KRINGLE
5
血管增生抑制因子
缺失突变体
结构与功能
在线阅读
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职称材料
人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化
被引量：
3
2
作者
蔡卫斌
李朝阳
+5 位作者
杨中汉
骆晓枫
周世豪
李民友
刘祖国
高国全
《中山大学学报（医学科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004年第3期241-244,共4页
【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将...
【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将其克隆进表达载体pET-22b(+)中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b(+)/K5 mut1 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2+-His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定?【结果】 PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mut1基因片段,正确插入pET-22 b(+)载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量Mr≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L?【结论】 成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白?
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关键词
纤溶酶原
突变型K5
血管增生抑制因子
基因突变
层析法
大肠杆菌
血管
增生
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职称材料
题名
纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域
被引量：
6
1
作者
李朝阳
蔡卫斌
杨中汉
杨霞
宋志宏
周世豪
李明友
刘祖国
高国全
机构
中山大学中山眼科中心
中山大学基础医学院生物化学教研室
广州市启源生物科技有限公司
出处
《中国生物化学与分子生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第1期17-23,共7页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.30370313
No.30570372)
+3 种基金
新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0792)
中华医学基金会资助项目(CMB-SUMS学者项目CMB98-677)
教育部回国人员基金资助项目(2003年)
广东省自然科学基金(No.04009426)~~
文摘
根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5mut2(Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板,用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段,定向克隆入pET22b(+)质粒载体,重组体转化进大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖,且活性强度是完整的K5蛋白2倍;K5mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示,完整的Kringle结构(包含3个二硫键)是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域,而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需.
关键词
纤溶酶原
KRINGLE
5
血管增生抑制因子
缺失突变体
结构与功能
Keywords
plasminogen
kringle 5
angiogenic inhibitor
deletion mutant
structure and function
分类号
R322.91 [医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]
R774.13 [医药卫生—眼科]
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职称材料
题名
人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化
被引量：
3
2
作者
蔡卫斌
李朝阳
杨中汉
骆晓枫
周世豪
李民友
刘祖国
高国全
机构
中山大学基础医学院生化教研室
中山大学中山眼科中心
中山大学广州市启源生物科技有限公司
出处
《中山大学学报（医学科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004年第3期241-244,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(30370313)
中华医学基金会资助项目(CMB-SUMS学者项目#98-677)
+2 种基金
教育部回国人员基金资助项目(2003)
广东省医学科研基金资助项目(A2003153)
广州市科技攻关重点基金资助项目(2003Z2-E4091)
文摘
【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将其克隆进表达载体pET-22b(+)中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b(+)/K5 mut1 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2+-His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定?【结果】 PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mut1基因片段,正确插入pET-22 b(+)载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量Mr≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L?【结论】 成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白?
关键词
纤溶酶原
突变型K5
血管增生抑制因子
基因突变
层析法
大肠杆菌
血管
增生
Keywords
plasminogen
kringle 5
angiogenic inhibitor
mutation
gene expression
分类号
R364.1 [医药卫生—病理学]
在线阅读
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域
李朝阳
蔡卫斌
杨中汉
杨霞
宋志宏
周世豪
李明友
刘祖国
高国全
《中国生物化学与分子生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
6
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化
蔡卫斌
李朝阳
杨中汉
骆晓枫
周世豪
李民友
刘祖国
高国全
《中山大学学报（医学科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004
3
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