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人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达 被引量：5
1
作者 高全文 董绍忠 +2 位作者 陈希哲 陈琰 杨连甲 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期32-34,共3页
目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体,并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法:利用基因克隆技术,将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用 BamH I和Xho I双酶切后,再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pc... 目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体,并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法:利用基因克隆技术,将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用 BamH I和Xho I双酶切后,再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导,用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞,然后以G418筛选阳性克隆,用免疫细胞化学鉴定。结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组体中已插入目的基因片段VEGF165。免疫细胞化学证实,重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论:成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165,并在骨髓基质细胞中得到表达,为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。 展开更多
关键词 基因表达 人血管内皮生长因子165 基因 真核表达载体 构建
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重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达 被引量：2
2
作者 刘煜 吴国祥 +4 位作者 赵建阳 颜天华 奚涛 沈子龙 成国祥 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期577-581,共5页
目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。... 目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论 :在Pichia酵母中成功表达人VEGF1 65。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子165 巴氏毕赤酵母 pPIC9K酵母表达载体 SDS-PAGE WESTERN-BLOT
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重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价 被引量：2
3
作者 周晓雷 朱重悦 +4 位作者 张世光 李海潮 张竞 王岩勃 邹卫 《科学技术与工程》 北大核心 2016年第1期42-46,共5页
人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表... 人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。 展开更多
关键词 人血管内皮生长因子165 融合蛋白 原核表达 蛋白纯化
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利用五特征转基因小鼠制备全人源血管内皮生长因子165单克隆抗体
4
作者 刘煜 顾月 +3 位作者 恽冬杰 陈建泉 刘思国 张爱民 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期269-272,共4页
目的:利用转入人免疫球蛋白基因的五特征小鼠制备全人源血管内皮生长因子165(VEGF165)单克隆抗体,并初步探讨该单抗的抗肿瘤活性。方法:采用常规杂交瘤细胞融合技术,利用间接ELISA效价测定方法筛选能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株;比较了... 目的:利用转入人免疫球蛋白基因的五特征小鼠制备全人源血管内皮生长因子165(VEGF165)单克隆抗体,并初步探讨该单抗的抗肿瘤活性。方法:采用常规杂交瘤细胞融合技术,利用间接ELISA效价测定方法筛选能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株;比较了五特征小鼠和BALB/c小鼠的免疫效果;亲和色谱法从腹水中纯化单抗;利用分泌VEGF的人膀胱癌细胞系T24细胞考察单抗的体外抗肿瘤活性。结果:成功获得了4株能稳定分泌表达单抗的杂交瘤细胞株(V2,V50,V71,V75),建立了间接ELISA效价测定方法,发现同样方法免疫的BALB/c鼠血清效价约为五特征小鼠的10倍。采用甘露糖结合蛋白(MBP)亲和色谱柱从腹水中获得了纯化的单抗样品,经SDS-PAGE和Western blotting检测,证实该单抗为全人源VEGF165IgM单抗。体外抗肿瘤活性结果显示,V2、V75单抗对人类膀胱癌细胞系T24细胞的增殖有较好的抑制作用。结论:可利用五特征小鼠制备全人源抗VEGF单抗,该单抗具有潜在的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 五特征小鼠 全人源单抗 抗肿瘤 血管内皮生长因子165
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血管内皮生长因子165b对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响 被引量：8
5
作者 赵燕颖 王秀岩 +3 位作者 秦国涛 孙远杰 刘志忠 李然伟 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期101-105,共5页
目的:探讨血管内皮生长因子165b(VEGF165b)对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法:HepG_2细胞分为空白组(仅加转染试剂)、对照组(转染阴性对照PcDNA3.0表达载体)和PcDNA-VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体PcDNA... 目的:探讨血管内皮生长因子165b(VEGF165b)对人肝癌HepG_2细胞生物学特性的影响,并初步研究其作用机制。方法:HepG_2细胞分为空白组(仅加转染试剂)、对照组(转染阴性对照PcDNA3.0表达载体)和PcDNA-VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体PcDNA-VEGF165b)。MTT法检测各组HepG_2细胞生存率,RT-PCR法和Western blotting法检测HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室法检测HepG_2细胞迁移能力。结果:与空白组比较,对照组HepG_2细胞中VEGF165b和VEGF165mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。与空白组比较,PcDNA-VEGF165b组细胞中VEGF165bmRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05),VEGF165 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。空白组和对照组细胞生存率比较差异无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,PcDNAVEGF165b组细胞生存率有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。细胞迁移实验,空白组和对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P<0.05);与空白组和对照组比较,PcDNA-VEGF165b组HepG_2细胞迁移率明显降低(P<0.05)。结论:VEGF 165b能抑制VEGF165基因和蛋白的表达,VEGF165b对肝癌细胞增殖无明显影响,但可降低肝癌细胞的迁移能力。 展开更多
关键词 肝肿瘤 HEPG2细胞 血管内皮细胞生长因子165b 血管内皮细胞生长因子165 细胞增殖 细胞迁移
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脑梗死大鼠经血管内皮生长因子165基因治疗后热休克蛋白70的表达 被引量：7
6
作者 胡明均 刘勇 +3 位作者 邓成国 常燕群 王家宁 董永章 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第7期720-722,共3页
目的观察脑梗死大鼠经血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗后热休克蛋白70(HSP70)的表达。方法将25只大鼠随机均分为以下5组:正常对照组(A组);假大脑中动脉闭塞(MCAO)组(B组);MCAO组;空载质粒对照组(D组);hVEGF165基因治疗组(E组)。建模... 目的观察脑梗死大鼠经血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗后热休克蛋白70(HSP70)的表达。方法将25只大鼠随机均分为以下5组:正常对照组(A组);假大脑中动脉闭塞(MCAO)组(B组);MCAO组;空载质粒对照组(D组);hVEGF165基因治疗组(E组)。建模7 d后采用免疫组化的方法观察各组动物脑组织中的HSP70 的表达。结果(1)在皮质中,A、B两组HSP70均低表达(P>0.05);C、D两组表达均较高(P>0.05),与A、B两组相比有较显著的差异(P<0.01);E组表达最强,与各组相比均有显著差异(P<0.01)。(2)在半暗带中,C、D、E各组HSP70 表达均较高,C、D两组间无显著差异(P>0.05),而E组显著高于C、D组(P<0.01)。(3)在梗死灶内,E 组表达较高,显著高于C、D组(P< 0.01)。结论经hVEGF165基因治疗的脑梗死大鼠HSP70表达显著增高,提示VEGF165基因可诱导HSP70的表达。 展开更多
关键词 脑梗死 大鼠 血管内皮生长因子 165基因 基因治疗 热休克蛋白70
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人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达 被引量：3
7
作者 沈庆煜 黎祥喷 +3 位作者 陶恩祥 肖颂华 王莉梅 邢诒刚 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第B03期152-155,共4页
【目的】构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF_(165))基因的重组腺病毒载体并观察其在 C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础。【方法】将 VEGF_(165)基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,获得重组质粒 ... 【目的】构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF_(165))基因的重组腺病毒载体并观察其在 C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础。【方法】将 VEGF_(165)基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,获得重组质粒 pAdTrack VEGF_(165)。经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 共同转染大肠杆菌 BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒 pAdCMV VEGF_(165),转化体外培养的 C17.2神经干细胞。通过 RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot 法检测其在 C17.2神经干细胞中的表达。【结果】重组腺病毒 AdCMV VEGF_(165)在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×10^(11)efu/mL。病毒上清液经 ELISA 检测VEGF_(165)表达的量为(1135±138)ng/L。重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达。【结论】成功构建 pAd VEGF_(165)重组腺病毒,获得了稳定表达 VEGF_(165)的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 腺病毒科 神经干细胞
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携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定 被引量：3
8
作者 周炜 冯进波 +4 位作者 王旭平 刘春喜 姜虹 王荣 丁士芳 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2009年第3期342-344,共3页
目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒... 目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类 腺病毒载体 基因重组 临床分析
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血管内皮生长因子165基因转染小鼠硬皮病皮损的实验研究 被引量：2
9
作者 胡美玲 阎国富 +3 位作者 黎智 何威 何云志 黄海 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期493-496,共4页
目的:探讨硬皮病基因治疗的新方法。方法:建立小鼠硬皮病动物模型后,应用电穿孔技术将血管内皮生长因子(VEGF)165真核表达质粒导入硬皮病小鼠硬化的皮下;再利用免疫组化、原位杂交法检测小鼠硬皮病皮损VEGF165的表达及观察组织病理改变... 目的:探讨硬皮病基因治疗的新方法。方法:建立小鼠硬皮病动物模型后,应用电穿孔技术将血管内皮生长因子(VEGF)165真核表达质粒导入硬皮病小鼠硬化的皮下;再利用免疫组化、原位杂交法检测小鼠硬皮病皮损VEGF165的表达及观察组织病理改变。结果:①转基因后硬皮病鼠毛发生长明显增多,而未转基因硬皮病鼠毛发未见生长。②组织病理检查示转基因鼠毛囊明显增生,毛囊数每一低倍视野平均为(12.0±1.6)个,显著高于未转基因硬皮病鼠组(P<0.05)。真皮厚度增加,新生血管增加。③免疫组化、原位杂交法检测示转基因鼠表皮和真皮细胞及间质VEGF165表达明显增加。结论:电穿孔技术可将外源性基因转入小鼠硬化的皮肤,使其高表达。外源性VEGF165基因转染后,可明显促进小鼠硬化的皮肤毛发生长,已萎缩的真皮组织增生。 展开更多
关键词 硬皮病 电穿孔 基因转移 血管内皮生长因子
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神经生长因子与血管内皮生长因子165双基因共表达载体的构建及鉴定 被引量：3
10
作者 范波胜 娄季宇 白宏英 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2013年第4期427-429,共3页
目的利用内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建神经生长因子(NGF)与血管内皮生长因子(VEGF)165双基因共表达载体pIRES-NGF-VEGF 165。方法用分子克隆技术,分别从人血细胞和胎心组织中获得NGF和VEGF 165基因,通过酶切将两者插入质粒pIRES中... 目的利用内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建神经生长因子(NGF)与血管内皮生长因子(VEGF)165双基因共表达载体pIRES-NGF-VEGF 165。方法用分子克隆技术,分别从人血细胞和胎心组织中获得NGF和VEGF 165基因,通过酶切将两者插入质粒pIRES中,构建重组载体pIRES-NGF-VEGF 165,并鉴定。结果测序证实,成功获得NGF基因(726bp)和VEGF 165基因(576bp),NheⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/NotⅠ双酶切显示,重组载体pIRES-NGF-VEGF 165含有NGF和VEGF 165基因片段,证实构建成功。结论成功构建重组pIRES-NGF-VEGF 165质粒,为进一步研究NGF及VEGF 165双基因治疗脑梗死奠定重要基础。 展开更多
关键词 神经生长因子 血管内皮生长因子类 质粒 脑梗死 克隆 分子
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重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达 被引量：2
11
作者 魏芳晶 王翠艳 +4 位作者 阴淑莹 张晓云 乔小娟 石秀换 李云霞 《中国心血管杂志》 2009年第5期366-369,共4页
目的探讨以腺相关病毒(rAAV)为血管内皮细胞生长因子165基因(VEGIF165)载体,在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其相关特性。方法 (1)全骨髓培养法提取培养MSCs,利用免疫组化法检测MSCs表面标志CD34、CD44;流式细胞分析法检测... 目的探讨以腺相关病毒(rAAV)为血管内皮细胞生长因子165基因(VEGIF165)载体,在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其相关特性。方法 (1)全骨髓培养法提取培养MSCs,利用免疫组化法检测MSCs表面标志CD34、CD44;流式细胞分析法检测CD90。(2)rAAV-VEGF165转染MSCs,采用ELISA及PCR检测VEGF的表达,比较转染前后细胞的变化情况,观察VEGF165基因转染对MSCs的影响。结果 (1)成功培养出MSCs,CD44阳性表达,CD34阴性表达,CD90阳性表达。(2)在转染rAAV-VEGF165后转染组上清中VFGF165分泌水平明显高于未转染组(p<0.05),5 d时达到高峰,此后表达开始下降。琼脂糖凝胶电泳可见高亮度条带。表明rAAv-VEGF165成功转染进MSCs细胞中,绘制生长曲线,显示rAAV-VEGF165基因转染后对MSC生长无影响。结论rAAV-VEGF表达载体可有效感染MSCs,并在体外高效表达,为MSCs联合基因治疗提供了实验依据。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类 基因 干细胞 血管
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高滴度腺病毒介导的绿色荧光蛋白和反义血管内皮生长因子165cDNA的制备 被引量：2
12
作者 崔正军 岑瑛 张洁 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期127-129,共3页
目的:制备高滴度腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒介导的反义血管内皮生长因子165(Ad-aVEGF_(165))cDNA。方法:人胚肾293腺病毒包装细胞转染第3代Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)cDNA后,反复冻融293细胞,提取腺病毒悬液,用氯化铯梯度... 目的:制备高滴度腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒介导的反义血管内皮生长因子165(Ad-aVEGF_(165))cDNA。方法:人胚肾293腺病毒包装细胞转染第3代Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)cDNA后,反复冻融293细胞,提取腺病毒悬液,用氯化铯梯度离心法纯化腺病毒,在荧光显微镜下测定Ad-GFP的滴度,用空斑法测定Ad-aVEGF_(165)cDNA的滴度。结果:获取了实验所需的第4代腺病毒液,Ad-GFP的滴度为9.5×109efu/ml,Ad-aVEGF_(165)cDNA的滴度为1.2×1010pfu/ml。结论:成功制备了高滴度的Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)cDNA。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 基困治疗 腺病毒载体 滴度
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血管内皮生长因子165通过抑制钙敏感性受体减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡 被引量：3
13
作者 章斌 许智惠 陶正贤 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2011年第1期26-32,共7页
目的:探讨血管内皮生长因子165(vascu-lar endothelial growth factor 165,VEGF165)在缺血/再灌注损伤中的抗细胞凋亡作用及与钙敏感性受体(calciumsensing receptor,CaSR)表达下调的关系。方法:新生鼠心肌细胞在模拟心肌缺血状态下孵育... 目的:探讨血管内皮生长因子165(vascu-lar endothelial growth factor 165,VEGF165)在缺血/再灌注损伤中的抗细胞凋亡作用及与钙敏感性受体(calciumsensing receptor,CaSR)表达下调的关系。方法:新生鼠心肌细胞在模拟心肌缺血状态下孵育2 h,然后在标准培养液中再培养24 h,从而建立一个模拟心肌缺血/再灌注模型。通过末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL法)检测心肌细胞凋亡。CaSR mRNA表达通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定。通过免疫印迹法(Westernblot)测定促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2含量。结果:模拟的缺血/再灌注后CaSR mRNA的表达(I/R组:2.6±0.4;对照组:1.0±0.3,P<0.01)和TUNEL阳性细胞增加(I/R组:15.3%±2.5%;对照组:2.9%±1.4%,P<0.01)。GdCl3、CaSR mRNA的表达(GdCl3组:4.5±0.6;I/R组:2.6±0.4,P<0.01)及TUNEL阳性细胞进一步增加(GdCl3组:25.4%±2.6%;I/R组:15.3%±2.5%,P<0.01),同时上调了Bax表达(GdCl3组:1.93±0.28;I/R组:1.50±0.21,P<0.01),下调了Bcl-2的表达(GdCl3组:0.82±0.18;I/R组:1.71±0.30,P<0.01)。VEGF165组Bax表达减少(GdCl3+VEGF165组:1.12±0.23;GdCl3组:1.93±0.28,P<0.05)和Bcl-2的表达增加(GdCl3+VEGF165组:2.56±0.54;GdCl3组:0.82±0.18,P<0.05),TUNEL阳性细胞减少(GdCl3+VEGF165组:11.8%±1.9%;GdCl3组:25.4%±2.6%,P<0.05),CaSR mRNA的表达下调(GdCl3+VEGF165组:1.5±0.4;GdCl3组:4.5±0.6,P<0.01)。结论:VEGF165通过抑制CaSR,促进Bcl-2和抑制Bax的表达来减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 钙敏感性受体 凋亡 心肌细胞 缺血/再灌注
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重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达 被引量：1
14
作者 高全文 柳春明 +1 位作者 宋慧锋 柴家科 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期192-195,共4页
目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况。方法将PCR获取的VEGF165目的基因插入到pAdTrack-CMV中,构建腺病毒穿... 目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况。方法将PCR获取的VEGF165目的基因插入到pAdTrack-CMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经PmeI酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落。提取质粒并用PacI酶切鉴定。线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒,并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度。体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察。转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VEGF165的表达水平。结果经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒。Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT-PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达。ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VEGF165,为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 腺病毒科 血管内皮生长因子类 骨髓基质细胞 基因疗法
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人血管内皮生长因子165基因慢病毒载体的构建及其在人胚胎神经干细胞中的表达 被引量：2
15
作者 敬华军 张宇 王晓斌 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2013年第5期694-696,共3页
目的:构建携带人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的慢病毒表达载体,转染人胚胎神经干细胞(hNSCs)并检测hVEGF165基因在hNSCs内的表达。方法:用RT-PCR法扩增出hVEGF165 cDNA,插入pCDH-CMV-copGFP慢病毒载体中,构建pCDH-hVEGF165慢病... 目的:构建携带人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的慢病毒表达载体,转染人胚胎神经干细胞(hNSCs)并检测hVEGF165基因在hNSCs内的表达。方法:用RT-PCR法扩增出hVEGF165 cDNA,插入pCDH-CMV-copGFP慢病毒载体中,构建pCDH-hVEGF165慢病毒表达载体,双酶切和测序鉴定,包装并转染hNSCs。荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达,流式细胞术(FCM)测定转染率,Western blot法检测细胞中hVEGF165的表达。结果:酶切及测序结果显示成功构建pCDH-hVEGF165重组慢病毒表达载体,转染7d后观察宿主细胞内有大量GFP表达,FCM测定转染率为63%,Western blot检测证实hVEGF165蛋白在hNSCs中过表达。结论:本实验成功构建了携带hVEGF165的慢病毒表达载体,并在hNSCs中过表达hVEGF165基因。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类 慢病毒载体 神经干细胞 转染
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经心包腔转染腺病毒血管内皮生长因子165基因对猪冠脉血管形成的影响
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作者 关怀敏 刘鹏 +2 位作者 解金红 曹林生 钱其军 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第3期464-466,共3页
目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用。方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头。采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌... 目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用。方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头。采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌梗死模型。构建后即刻,实验组采用经皮剑突下穿刺,中心静脉导管插入心包腔内,以含胶原酶1200u及透明质酸酶3000u的生理盐水2ml预处理心包后,在心包腔内注入含Ad VEGF165基因2.0×109pfu的生理盐水1ml;对照组同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1ml。注射后3d(n=2)、7d(n=2)及28d(n=6)分别用免疫组化、超声心动图检测缺血心肌血管新生情况及心功能,并以酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆及心肌组织中Ad VEGF165的表达。结果:Ad VEGF165基因经心包腔转染缺血心肌组织后,在心肌组织中呈高表达,于7d达到高峰,28d降至基线水平,血浆中无目的基因的表达;28d时,实验组缺血心肌微血管密度(MVD)、心功能均明显高于对照组(MVD(517.00±75.70)mm-2vs(226.50±54.10)mm-2,P=0.009;LVEF(%)(72.11±5.20)vs(55.14±4.37),P=0.005)。结论:用胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,经其转染Ad VEGF165可以诱导急性心肌梗死模型局部VEGF蛋白表达,促进缺血心肌组织血管新生并能改善心功能。 展开更多
关键词 基因转染 基因治疗 血管内皮生长因子 心包腔 猪
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人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用
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作者 赵仲艳 韦映梅 +5 位作者 黎祥喷 吕瑞妍 肖颂华 刘中霖 邢诒刚 刘军 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期576-581,共6页
【目的】构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载... 【目的】构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。 展开更多
关键词 人血管内皮细胞生长因子 慢病毒 载体构建 HT22细胞 放射治疗
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血管内皮生长因子165和肝细胞生长因子促心肌梗死后心肌细胞增生机制的研究 被引量：7
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作者 钱雪松 安丰慧 +5 位作者 刘普 陈波 李春坚 王连生 杨志健 陶正贤 《中国循环杂志》 CSCD 北大核心 2014年第8期634-638,共5页
目的:探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)和肝细胞生长因子(HGF)促进心肌梗死后心肌细胞增生机制的异同。方法:将15头雄性中华小型猪结扎冠状动脉左前降支构建心肌梗死模型。实验动物分成三组:对照组、VEGF基因重组腺病毒载体组(Ad-VEGF... 目的:探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)和肝细胞生长因子(HGF)促进心肌梗死后心肌细胞增生机制的异同。方法:将15头雄性中华小型猪结扎冠状动脉左前降支构建心肌梗死模型。实验动物分成三组:对照组、VEGF基因重组腺病毒载体组(Ad-VEGF组)、HGF基因重组腺病毒载体组(Ad-HGF组),每组5只。将1×1010pfu的AdVEGF和Ad-HGF分别局部注射到Ad-VEGF组和Ad-HGF组猪的心肌梗死周围区,相同剂量的生理盐水注射到对照组。通过门控单光子发射计算机成像仪检测心肌灌注和心脏功能,通过免疫印迹法检测VEGF165和HGF在心肌的表达,采用免疫荧光双染和免疫共沉淀分析心肌细胞增生。结果:1在Ad-VEGF组,心肌梗死区和梗死周围区的VEGF165表达明显高于正常心肌(P<0.01);在Ad-HGF组,心肌梗死区和梗死周围区的HGF表达明显高于正常心肌(P<0.01)。2高表达的VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心脏功能。3VEGF165和HGF可促进梗死区和梗死周围区心肌细胞增生。4VEGF165通过p27促心肌细胞增生。5HGF通过p21和p27促心肌细胞增生。结论:VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心脏功能,促心肌细胞增生,但VEGF165和HGF促心肌细胞增生途径不同。 展开更多
关键词 心肌梗死 血管内皮生长因子 肝细胞生长因子 增生
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人血管内皮生长因子165的克隆和在大肠杆菌中的表达 被引量：1
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作者 张志兵 徐丰 +1 位作者 陈惠黎 金由辛 《上海医科大学学报》 CSCD 1999年第3期184-186,共3页
克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠... 克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果经测序表明，克隆的ＶＥＧＦ１６５与文献报道相符，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后，ＶＥＧＦ１６５在大肠杆菌中表达出。结论克隆和表达出ＶＥＧＦ１６５。 展开更多
关键词 血管内皮 生长因子 克隆 VEGF165 大肠杆菌
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重组血管内皮生长因子165对肝硬化大鼠肝功能的影响
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作者 于良立 赵金满 蒋伟伟 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1092-1095,共4页
目的探讨经门静脉导入重组血管内皮生长因子165对肝硬化大鼠肝功能的影响。方法雄性SD大鼠50只,体质量180~220 g,完全随机分成正常组10只、诱导模型组40只。采用硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法,10周后成模25只。模型组随机分为肝硬化实验... 目的探讨经门静脉导入重组血管内皮生长因子165对肝硬化大鼠肝功能的影响。方法雄性SD大鼠50只,体质量180~220 g,完全随机分成正常组10只、诱导模型组40只。采用硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法,10周后成模25只。模型组随机分为肝硬化实验组15只和肝硬化对照组10只。实验组经门静脉插管植入Alzet微渗泵灌注血管内皮生长因子入门静脉,持续作用2周。正常组和肝硬化对照组行开腹后关腹对照处理。2周后处死各组大鼠,HE染色观察大鼠肝脏病理组织学改变;全自动生化分析仪检测血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）和总胆红素（TBIL）含量。结果肝硬化对照组肝细胞变性坏死、弥漫纤维结缔组织增生,有假小叶形成。而肝硬化实验组变性坏死程度减轻,纤维结缔组织增生范围缩小,纤维化分级有明显改善,差异具有统计学意义（P〈0.01）。肝硬化对照组ALT、AST、TBIL均显著升高,ALB下降,同正常组相比差异具有统计学意义（P〈0.01）。肝硬化实验组同肝硬化对照组比较,ALT、AST、TBIL均显著下降,ALB上升,差异具有统计学意义[（115.71±12.63）U/L vs（192.36±21.84）U/L;（196.26±18.45）U/L vs（295.11±31.78）U/L;（6.32±1.32）μmol/L vs（10.69±2.47）μmol/L;（14.57±1.92）g/L vs（9.90±1.27）g/L;P〈0.01）]。结论经门静脉灌注血管内皮生长因子165具有改善肝硬化大鼠肝脏功能的作用。 展开更多
关键词 肝硬化 血管内皮生长因子 肝功能
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