血清3型鸭甲型肝炎病毒TaqMan RT-qPCR检测方法的建立及初步应用 被引量：3

1

作者 范鑫 吴凤瑶 +6 位作者 卢凤英 晁锦 张敬峰 董永毅 徐正军 索郎斯珠 张小飞 《中国家禽》 北大核心 2019年第16期34-39,共6页

根据GenBank中已发布的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)基因序列,针对VP1基因序列的保守区域设计一对引物及一条特异性TaqMan探针建立了DHAV-3的TaqMan荧光定量检测方法(TaqManRT-qPCR)。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的TaqManRT-... 根据GenBank中已发布的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)基因序列,针对VP1基因序列的保守区域设计一对引物及一条特异性TaqMan探针建立了DHAV-3的TaqMan荧光定量检测方法(TaqManRT-qPCR)。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的TaqManRT-qPCR方法在6.39×10^8~6.39×10^0拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,R2值为0.999。该方法能特异地检测出DHAV-3,与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)及其他常见鸭病病原无交叉反应,且组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。用普通RT-PCR方法和建立的TaqManRT-qPCR方法,对63份临床疑似鸭肝炎的肝组织样品进行检测,结果RT-PCR方法检出DHAV-3的阳性率是34.92%(22/63),TaqManRT-qPCR方法检出的阳性率是41.27%(26/63);对49份DHAV-3感染康复鸭的肛拭子样品进行检测,RT-PCR和TaqManRT-qPCR方法检出阳性率分别为22.45%(11/49)和85.71%(42/49);用TaqManRT-qPCR方法和鸡胚半数致死量法(ELD50)对DHAV-3(SD70株)鸡胚病毒含量进行检测比较,两种方法检测结果呈正相关。结果表明所建立的TaqManRT-qPCR检测方法特异性好,灵敏度高,为DHA-3快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多

关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 TaqMan实时荧光定量PCR

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血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：6

2

作者 孙庆歌 薛霜 +7 位作者 肖爱芳 马慧慧 朱薇 漆世华 温文生 舒银辉 谢红玲 苏敬良 《中国兽药杂志》 2013年第4期1-5,共5页

通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3... 通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒(H9)、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1.8×103～1.8×108copies/μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0.992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多

关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 实时荧光定量RT—PCR

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血清3型鸭甲型肝炎病毒弱毒疫苗株培育及免疫原性研究 被引量：5

3

作者 苏敬良 张国中 +7 位作者 黄瑜 苏文良 胡薛英 韩博 何伟勇 张大丙 赵继勋 郭玉璞 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2009年第12期11-14,共4页

近年来鸭甲型肝炎病毒血清3型引起的小鸭肝炎在我国广泛流行,严重危害着肉鸭养殖业。本研究采用鸭胚连续传代对血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株进行致弱,通过检测不同代次的鸭胚组织毒的毒力、稳定性及免疫原性,结果发现该病毒在鸭胚中连... 近年来鸭甲型肝炎病毒血清3型引起的小鸭肝炎在我国广泛流行,严重危害着肉鸭养殖业。本研究采用鸭胚连续传代对血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株进行致弱,通过检测不同代次的鸭胚组织毒的毒力、稳定性及免疫原性,结果发现该病毒在鸭胚中连续传代至第53代以后对雏鸭无致病性,在雏鸭体内连续继代不出现毒力返强。雏鸭经颈部皮下接种5×105.9ELD50的第54代病毒后可刺激机体产生坚强的免疫力。1日龄雏鸭免疫后4 d对强毒感染的保护指数为81.4%,免疫后6天的保护指数为100%。3日龄雏鸭免疫后5 d攻毒保护率为100%。1日龄雏鸭免疫后1周,血清中和抗体水平为10-3.29,至第4周达到高峰,之后开始缓慢下降。试验结果表明,3型鸭甲型肝炎病毒株第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力稳定,雏鸭接种后诱导产生的免疫力完全可以保护小鸭渡过鸭肝炎易感期。 展开更多

关键词 鸭甲型肝炎病毒 血清型3型 弱毒疫苗

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一株血清3型鸭甲型肝炎病毒的鉴定及致病性分析 被引量：2

4

作者 提金凤 李志杰 毛红彦 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第5期24-30,共7页

为明确从山东某鸭场分离的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的致病性和遗传特征,首先对分离鉴定的毒株进行VP1基因序列测定,与GenBank中发布的基因序列比对,并进行动物试验。分离的病毒株命名为DHAV-3-SDWF,2008~2020年分离的DHAV-3毒株... 为明确从山东某鸭场分离的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的致病性和遗传特征,首先对分离鉴定的毒株进行VP1基因序列测定,与GenBank中发布的基因序列比对,并进行动物试验。分离的病毒株命名为DHAV-3-SDWF,2008~2020年分离的DHAV-3毒株主要Ⅰ和Ⅱ基因型,基因Ⅰ型又形成Ⅰa和Ⅰb两个分支,该病毒属于Ⅰa分支。DHAV-3-SDWF对雏鸭致病性强,攻毒鸭的肝脏、脾脏、肾脏等器官剖检变化和组织病变明显,这与该病毒在各组织器官中的转录水平是一致的。总之,DHAV-3的分离鉴定及致病性分析,为该病分子流行病学研究及疫苗研制提供了材料和理论支撑。 展开更多

关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 系统发育进化树分析 致病性分析 病毒载量

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血清3型鸭甲型肝炎病毒阳性血清的制备

5

作者 孙庆歌 肖爱芳 +6 位作者 李晶梅 祝春花 李建 朱薇 廖园园 漆世华 谢红玲 《中国兽药杂志》 2014年第9期1-3,共3页

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗免疫SPF鸡,制备了一批血清3型鸭甲型肝炎诊断用阳性血清,并对其进行了无菌、支原体和特异性检验以及中和效价测定。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血... 通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗免疫SPF鸡,制备了一批血清3型鸭甲型肝炎诊断用阳性血清,并对其进行了无菌、支原体和特异性检验以及中和效价测定。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。本研究为鸭甲型肝炎病毒血清学鉴定及相关研究提供了重要的物质基础。 展开更多

关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 阳性血清 SPF鸡

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2020—2023年山东地区13株3型鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

6

作者 邹志强 马芹 +10 位作者 汪建华 王胜 孟超 许明清 赵杰 张中波 石艳红 刘子涵 魏书强 马元元 李玉峰 《中国家禽》 北大核心 2024年第7期60-66,共7页

为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa... 为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa分支,且分属于GⅠa分支不同小分支,其中2020年分离株(20148、20149)与2021年商品肉鸭分离株(SP21042)核苷酸相似性在98.8%~100%;2023年商品鸭分离株(SP23012、SP23014、SP-2、SP-3、SP23009)核苷酸相似性在99.7%~100%;2021年种鸭分离株(21083)与2022年、2023年种鸭分离株(22443、22468、BL23028)、2023年商品鸭分离株(SP23010)核苷酸相似性在98.8%~99.4%,小分支内相似性均高于98.8%,不同小分支间相似性在96.9%~98.2%;2023年部分3型DHAV分离株VP1基因出现了个别氨基酸位点的突变。研究表明,山东地区分离的13株GⅠa分支鸭甲型肝炎病毒VP1基因出现了变异,需要加以关注。 展开更多

关键词 3型鸭甲型肝炎病毒 鸭 分离鉴定 VP1基因

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血清Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备与初步应用 被引量：1

7

作者 陈长春 王永娟 +1 位作者 崔平福 朱善元 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第3期152-157,共6页

为研制血清Ⅰ型鸭肝炎病毒主要的结构蛋白之一VP3蛋白的单克隆抗体,将鸭肝炎病毒免疫BALB/c小鼠,利用原核表达的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3重组蛋白作为抗原进行筛选以及3次亚克隆后,获得了一株(2G3)能够稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细... 为研制血清Ⅰ型鸭肝炎病毒主要的结构蛋白之一VP3蛋白的单克隆抗体,将鸭肝炎病毒免疫BALB/c小鼠,利用原核表达的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3重组蛋白作为抗原进行筛选以及3次亚克隆后,获得了一株(2G3)能够稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,单克隆抗体亚类鉴定为IgG1,ELISA检测腹水效价为1∶12800。鉴定结果表明制备的单克隆抗体效价高,反应原性强,为后续建研制血清Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒的快检试剂盒及建立病原及抗体检测方法奠定基础。 展开更多

关键词 Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒 VP3基因 单克隆抗体

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3型鸭甲型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增技术快速检测方法的建立 被引量：4

8

作者 张映 范书才 +2 位作者 张兵 陈玲 秦义娴 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期963-967,共5页

为建立一种3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的快速检测方法,本研究针对DHAV-3 VP1基因序列中的8个不同区段设计了3对特异性引物,并对反应体系进行优化,通过加入羟基萘酚蓝(HNB)实现对反应结果的可视化观察,建立了检测DHAV-3的逆转录环介导等... 为建立一种3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的快速检测方法,本研究针对DHAV-3 VP1基因序列中的8个不同区段设计了3对特异性引物,并对反应体系进行优化,通过加入羟基萘酚蓝(HNB)实现对反应结果的可视化观察,建立了检测DHAV-3的逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法,采用已建立的方法对人工感染雏鸭的血清样品和病死鸭肝组织样品提取的核酸进行了检测。结果显示,该方法仅对DHAV-3的RNA进行扩增,而对1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)以及鸭常见的病原RNA均无扩增反应;可以检测出10拷贝/μL的DHAV-3 RNA,其敏感性为RT-PCR的1 000倍;最低能够检测到相当于1.1个DELD50的DHAV-3;能够检测到人工感染雏鸭血清和病死鸭肝组织中的DHAV-3;上述结果表明该方法能够特异、灵敏、快速地检测DHAV-3,而且使用方便。 展开更多

关键词 3型鸭甲型肝炎病毒 RT-LAMP 检测

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Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定 被引量：2

9

作者 王安平 朱善元 +3 位作者 王永娟 吴双 左伟勇 洪伟鸣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期649-653,共5页

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移... 为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒 VP3基因 昆虫细胞 表达 鉴定

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鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用 被引量：1

10

作者 孙庆歌 刘丹 +7 位作者 肖爱芳 李晶梅 祝春花 李建 朱薇 廖园园 漆世华 谢红玲 《家禽科学》 2016年第2期12-15,共4页

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗毒免疫SPF鸡,制备血清3型鸭甲型肝炎诊断用标准阳性血清,对制备血清进行无菌、支原体和特异性检验以及效价测定,并用该抗血清进行鸭病毒性肝炎治疗试验。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异... 通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗毒免疫SPF鸡,制备血清3型鸭甲型肝炎诊断用标准阳性血清,对制备血清进行无菌、支原体和特异性检验以及效价测定,并用该抗血清进行鸭病毒性肝炎治疗试验。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。发病雏鸭紧急治疗保护率为91.67%,而与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)无交叉保护。 展开更多

关键词 血清3型鸭甲型肝炎病毒 抗血清 治疗

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血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

11

作者 黄军生 宋翠萍 +7 位作者 孙英杰 仇旭升 孟春春 谭磊 廖瑛 刘炜玮 王桂军 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第3期146-151,共6页

血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)属于小RNA病毒科,主要引起雏鸭以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病。DHAV-3有3个主要结构蛋白,其中VP0蛋白具有极佳的抗原性及宿主保护位点。为研制鸭肝炎病毒VP0蛋白的单克隆抗体,本研究将鸭肝炎... 血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)属于小RNA病毒科,主要引起雏鸭以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病。DHAV-3有3个主要结构蛋白,其中VP0蛋白具有极佳的抗原性及宿主保护位点。为研制鸭肝炎病毒VP0蛋白的单克隆抗体,本研究将鸭肝炎病毒的VP0基因进行原核表达,用纯化后的重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、IFA筛选以及亚克隆后,获得了1株能够稳定分泌抗VP0蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3A5,亚类鉴定为IgG1,IFA检测腹水效价为1∶12800。Western blot、IFA结果表明,制备的单克隆抗体效价高,反应原性强。本研究为后续建研制血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒的快检试剂盒,及建立病原及抗体检测方法奠定基础。 展开更多

关键词 血清Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒 VP0基因 原核表达 单克隆抗体

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血清1型鸭甲型肝炎病毒实时定量PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：2

12

作者 孙庆歌 李晶梅 +7 位作者 朱薇 肖爱芳 赖志 薛霜 高俊锋 马慧慧 祝春花 谢红玲 《中国兽药杂志》 2014年第12期17-21,共5页

为建立一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)的实时定量PCR方法,根据Gen Bank中DHAV-1 5’非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条Taq Man探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重... 为建立一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)的实时定量PCR方法,根据Gen Bank中DHAV-1 5’非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条Taq Man探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重复性试验以及临床病料检测初步应用。结果,该方法与血清3型鸭甲型肝炎病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒等无交叉反应性;最低可以检测到10 copies/μL;组内和组间变异系数均小于3%;临床病料的检测结果与测序检测结果一致。结果表明,所建立的实时定量检测方法具有特异、敏感、稳定等优点,可用于DHAV-1的快速检测与定量分析。 展开更多

关键词 血清1型鸭甲型肝炎病毒:实时定量PCR TAQMAN探针

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I型鸭肝炎病毒3C蛋白的原核表达和免疫学检测

13

作者 杨洋 宋翠萍 +2 位作者 卢凤英 丁铲 彭大新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第6期37-41,共5页

本研究采用原核表达载体p ET-32a在大肠杆菌中表达血清I型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis virus serotype I,DHV-I)SH株的3C蛋白,经超声波裂解结果显示,p ET-3C融合蛋白呈现可溶性表达。利用His-bind Resin试剂盒纯化该产物,作为免疫原... 本研究采用原核表达载体p ET-32a在大肠杆菌中表达血清I型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis virus serotype I,DHV-I)SH株的3C蛋白,经超声波裂解结果显示,p ET-3C融合蛋白呈现可溶性表达。利用His-bind Resin试剂盒纯化该产物,作为免疫原免疫小鼠,制备特异性抗体进行免疫学检测。结果表明,该抗体与原核表达产物、DHV感染的SPF尿囊液总蛋白呈现特异性反应。由此可见,3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达,制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。 展开更多

关键词 I型鸭甲型肝炎病毒 3C蛋白 原核表达

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3型鸭病毒性肝炎的诊断与病毒的分离鉴定 被引量：3

14

作者 韩相敏 马晶晶 +3 位作者 高俊锋 吴碧清 张秉金 赖志 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第12期60-62,I0006,共4页

江苏某鸭场5日龄雏鸭发病,并在发病后很快死亡,剖检可见肝脏肿大,有出血点或出血斑,采集雏鸭肝脏进行PCR鉴定,确定为3型鸭甲型肝炎病毒引发的鸭病毒性肝炎,建议鸭场紧急接种高免卵黄抗体;同时在实验室进行病毒的分离和鉴定:将死亡雏鸭... 江苏某鸭场5日龄雏鸭发病,并在发病后很快死亡,剖检可见肝脏肿大,有出血点或出血斑,采集雏鸭肝脏进行PCR鉴定,确定为3型鸭甲型肝炎病毒引发的鸭病毒性肝炎,建议鸭场紧急接种高免卵黄抗体;同时在实验室进行病毒的分离和鉴定:将死亡雏鸭肝脏接种10日龄鸭胚,分离到1株病毒,经纯净性检验、PCR鉴定和中和试验确定为3型鸭甲型肝炎病毒,命名为DHAV-3 JS株。将DHAV-3 JS株通过人工感染雏鸭,雏鸭死亡率为70%,表明JS株毒力较强。 展开更多

关键词 3型鸭甲型肝炎病毒 诊断 分离鉴定

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