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18~65岁人群重组结核杆菌融合蛋白皮肤试验应用剂量及在3~17岁和66~75岁人群中的安全性:一项随机、盲法、阳性对照Ⅱ期临床试验
1
作者 王敬 王庆枫 +5 位作者 荆玮 王宇津 王雪钰 黄海荣 初乃惠 聂文娟 《中国防痨杂志》 北大核心 2025年第7期840-845,共6页
背景:结核菌素皮肤试验使用结核菌素纯蛋白衍生物,广泛用于结核病筛查,但结核菌素皮肤试验无法明确区分结核分枝杆菌潜伏感染、卡介苗免疫和活动性结核病。因此,需要开发更准确的结核病诊断方法。重组结核杆菌融合蛋白由结核分枝杆菌标... 背景:结核菌素皮肤试验使用结核菌素纯蛋白衍生物,广泛用于结核病筛查,但结核菌素皮肤试验无法明确区分结核分枝杆菌潜伏感染、卡介苗免疫和活动性结核病。因此,需要开发更准确的结核病诊断方法。重组结核杆菌融合蛋白由结核分枝杆菌标准株H37Rv的早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)蛋白组成,具有诊断结核分枝杆菌潜伏感染、结核病和卡介苗接种后状态的作用。方法:研究分两个阶段进行,第一阶段采用随机、盲法、同类制品对照的同体双臂皮试设计,比较不同剂量组重组结核杆菌融合蛋白、对照试剂在18~65岁结核病患者中的敏感度及健康受试者、非结核性肺部疾病患者中的特异度;计算不同剂量组重组结核杆菌融合蛋白的受试者工作特征曲线(ROC曲线)及曲线下面积(AUC),评价试验药物的最佳诊断试验分界值;分别评价重组结核杆菌融合蛋白、对照试剂及γ干扰素释放试验3种检测试剂的一致率,同时评价重组结核杆菌融合蛋白的安全性。第二阶段采用开放性、单臂研究设计,受试者单臂给药,评价重组结核杆菌融合蛋白在3~17岁和66~75岁人群中应用的安全性。讨论:本研究旨在对重组结核杆菌融合蛋白用于结核分枝杆菌潜伏感染和结核病诊断的评估和用药安全性评价,期望通过临床研究,将基于重组结核杆菌融合蛋白的结核病诊断技术手段推广到更广泛的人群和临床应用中。 展开更多
关键词 结核 重组融合蛋白质类 临床试验
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HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化 被引量：2
2
作者 杨思睿 卫红飞 +5 位作者 孙景辉 杨煜 王燕媚 鲁继荣 于永利 王丽颖 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期11-14,共4页
目的:构建热休克蛋白65(HSP65)与沙眼衣原体(C．trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP) T细胞表位(简称ctml)融合蛋白(简称H-ctml)的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法:用PCR技术获得HSP65基因和ctml基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,... 目的:构建热休克蛋白65(HSP65)与沙眼衣原体(C．trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP) T细胞表位(简称ctml)融合蛋白(简称H-ctml)的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法:用PCR技术获得HSP65基因和ctml基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctml基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctml的基因重组。用IPTG诱导转化H—ctml表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果:构建了HSP65与ctml的表达载体pET28a-H—ctml,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98％的融合蛋白质。结论:用分子克隆技术正确构建HSP65与 Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。 展开更多
关键词 热休克蛋白65 衣原体 沙眼 表位 T淋巴细胞 聚合酶链反应/方法 重组融合蛋白质类
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谷胱甘肽-S-转移酶-人表皮生长因子融合蛋白基因的表达及其产物的生物活性 被引量：5
3
作者 智庆文 李前 +3 位作者 王淑豪 王玉霞 李仕贵 孙曼霁 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期113-117,共5页
目的　通过融合蛋白的表达使人表皮生长因子(hEGF)易于纯化。方法　构建基于tac启动子的pGEX 4T-1-hEGF原核表达载体,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 1 硫代-β-D半乳糖苷诱导,表达谷胱甘肽 S 转移酶(GST) hEGF融合蛋白。结果　... 目的　通过融合蛋白的表达使人表皮生长因子(hEGF)易于纯化。方法　构建基于tac启动子的pGEX 4T-1-hEGF原核表达载体,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 1 硫代-β-D半乳糖苷诱导,表达谷胱甘肽 S 转移酶(GST) hEGF融合蛋白。结果　表达产物占细菌总蛋白的3 4%。部分为可溶性的,部分形成包涵体。菌体裂解上清液经GlutathioneSepharose 4B纯化后,SDS PAGE电泳出现一条3 2ku蛋白条带,与GST hEGF融合蛋白的计算分子量相符。菌体裂解液中的可溶性GST hEGF的产率为63mg·L- 1 。将其添加到培养的HEK-2 93细胞中,能明显促进该细胞的分裂和生长。结论　成功地构建并表达了GST-hEGF融合蛋白基因,其表达产物GST 展开更多
关键词 融合蛋白质类 谷胱甘肽转移酶 生长物质 基因表达
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结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值 被引量：11
4
作者 刘忠华 丁元生 +5 位作者 毕爱笑 冯永红 金瑞良 杨华 秦莲花 胡忠义 《中国防痨杂志》 CAS 2009年第10期565-569,共5页
目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),1... 目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),16 kD,38 kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65 kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 血清学试验
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究 被引量：7
5
作者 王平 王丽梅 +5 位作者 张薇 柏银兰 康健 郝彦斐 罗泰来 徐志凯 《中国防痨杂志》 CAS 2012年第3期145-149,共5页
目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、... 目的评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性。方法6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、BCG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只)。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,innersalt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平。结果Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)%]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)%](t=12.252,P<0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)%](t=20.166,P<0.05)。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P>0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spotforming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P<0.05)。结论Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。 展开更多
关键词 分枝杆菌 耻垢 重组融合蛋白质类 结核菌苗 免疫活性
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冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)原液效力评价用国家参考品的初步建立 被引量：4
6
作者 都伟欣 韦芬 +4 位作者 卢锦标 赵爱华 蒲江 王国治 徐苗 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第8期826-831,共6页
目的以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液为... 目的以冻干重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](以下简称"EC")原液为原材料,研制EC变态反应原原液效力评价用国家参考品。方法以电泳法、高效液相色谱法分别测定备选EC原液纯度,纯度合格后经精密称量、分装、冻干制成候选国家参考品,再测定其蛋白质和水分含量。将候选国家参考品稀释成不同稀释度后,皮内注射结核分枝杆菌活菌致敏的豚鼠,根据皮肤试验硬结或红晕反应平均直径大小(简称"反应平均直径大小")结果探索原液效价测定的适宜稀释度。在此基础上,将候选国家参考品用于EC原液的效价测定并进行方法验证,初步评价其适用性能。研究还初步观察了候选品在-20℃放置24个月的稳定性。结果 EC原液电泳法纯度为100.00%,高效液相色谱法纯度为95.33%,候选国家参考品蛋白质含量为508μg/瓶,水分含量为1.57%,分装精度控制在±1%以内。稀释度探索结果显示:候选品稀释度为2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)和10μg/ml(50U/ml)时剂量对数反应平均直径大小曲线有良好的线性关系(R^2=0.9944),可作为后续研究的适宜稀释度。将候选国家参考品用于EC原液效价测定,两者剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9878,R^2=0.9643),且每个稀释度EC原液与相应稀释度候选国家参考品反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2。方法验证结果显示:候选国家参考品和EC原液的剂量对数反应平均直径大小曲线趋势基本一致(R^2=0.9999,R^2=0.9815),且两者相应稀释度反应平均直径大小的比值均满足1.0±0.2,方法可行。初步稳定性研究结果显示:-20℃放置24个月的候选国家参考品效价测定性能稳定。结论候选国家参考品的纯度、蛋白质含量、水分含量及均匀性检测均符合国家参考品质量要求,将其稀释到适宜稀释度后可用于EC原液的效价测定;经方法验证与稳定性观察,显示其性能良好,为国家参考品申报提供了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 冷冻干燥法 参考标准 国家参考品 效价
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8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化 被引量：3
7
作者 唐艳 李慧 +6 位作者 张培因 李大鹏 王燕媚 卫红飞 王爱丽 于永利 王丽颖 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期21-24,共4页
目的 :构建蛋白质转导结构域 8个精氨酸聚合体 (8R)与 MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体 ,并表达、纯化出具有生物学活性的 8R- MUC1核心肽融合蛋白。方法 :以 PCR法从 HSP6 5 - MUC1- p ET2 8a质粒中钓取 MUC1核心肽 2个重复序列片段 ... 目的 :构建蛋白质转导结构域 8个精氨酸聚合体 (8R)与 MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体 ,并表达、纯化出具有生物学活性的 8R- MUC1核心肽融合蛋白。方法 :以 PCR法从 HSP6 5 - MUC1- p ET2 8a质粒中钓取 MUC1核心肽 2个重复序列片段 ,连入 p MD18- T载体 ,然后用酶切、连接的方法从 T载体上获得 MU C1核心肽 6重复序列片段 (MU CPT) ,将其克隆入含 8R的 p ET2 6 b+ 原核表达载体中构建 8R与 MU CPT融合蛋白(8R- MU CPT)表达载体。用 IPTG诱导转化 8R- MU CPT表达载体的大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,并以镍螯合层析法纯化 8R- MU CPT融合蛋白。结果 :构建了 8R与 MU C1核心肽 6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R- MUCPT- p ET2 6 b+ ,并在 BL2 1(DE3)中表达了 8R- MU CPT融合蛋白 ,经镍螯合层析获得纯度为 95 .5 %的8R- MUC1核心肽融合蛋白。结论 :构建了 8R- MU C1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。 展开更多
关键词 MUC1 核心肽 精氨酸聚合体 重组融合蛋白质类 载体蛋白类 聚合酶链反应/方法
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人IP-10融合蛋白表达载体的构建和表达及活性鉴定 被引量：4
8
作者 邵紫韫 刘志锋 +4 位作者 彭毅 徐佳 秦清和 邓鹏 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期898-901,共4页
目的构建人His标记的IP-10(interferon-γ-inducibleprotein10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。方法从人肺cDNA文库中PCR扩增无信... 目的构建人His标记的IP-10(interferon-γ-inducibleprotein10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。方法从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的IP-10基因编码序列,构建重组载体pET-14b/IP-10;重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株;经异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导后,用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白,以THP-1细胞进行微室跨膜迁移(transwell)实验鉴定融合蛋白活性。结果酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确,并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白。而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性。结论成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体,并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白,为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料。 展开更多
关键词 γ干扰素诱导蛋白10 融合蛋白质类 细胞运动
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HLA—A0201与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在K562细胞的表达和定位 被引量：3
9
作者 何贤辉 徐丽慧 +2 位作者 刘毅 蔡小嫦 曾耀英 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期705-710,共6页
目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与HLA -A 0 2 0 1(A 0 2 0 1)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体 ,分析其在K5 6 2细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT -PCR方法克隆A 0 2 0 1cDNA ,构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,转染K5 6 2... 目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与HLA -A 0 2 0 1(A 0 2 0 1)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体 ,分析其在K5 6 2细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT -PCR方法克隆A 0 2 0 1cDNA ,构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,转染K5 6 2细胞 ,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果 :从两个HLA -A2阳性供者外周血细胞中克隆到A 0 2 0 1cDNA编码区全长序列。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码 ,成功构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K5 6 2细胞 ,5h后A 0 2 0 1和EGFP的表达百分率分别为 2 5 12± 2 2 6、2 7 37± 3 5 9,2 4h后表达水平无明显提高。表达的融合蛋白主要分布于细胞膜上 ,胞内分布较少。相反 ,转染空载体的细胞不表达A 0 2 0 1分子 ,仅表达EGFP ,且其在细胞内呈弥散样分布。结论 :成功构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,并在K5 6 2细胞中得到表达 ,表达产物主要分布于细胞膜表面 ,提示表达该融合蛋白的K5 6 2细胞是潜在的人工抗原提呈细胞。 展开更多
关键词 HKA—A2抗原 绿色荧光蛋白质类 融合蛋白质类 显微镜检查 共焦
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pEGFP/hVEGF121融合蛋白真核表达载体的构建及在骨髓间质干细胞中的表达 被引量：3
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作者 苏立 陈运贞 +1 位作者 张晓刚 张润峰 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期1681-1685,共5页
目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在骨髓间质干细胞(MSC)中的表达。方法:采用PCR技术,以pCD/hVEGF121质粒为模板扩增VEGF121基因全长,采用PCR产物的粘端克隆法,将VEGF121... 目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在骨髓间质干细胞(MSC)中的表达。方法:采用PCR技术,以pCD/hVEGF121质粒为模板扩增VEGF121基因全长,采用PCR产物的粘端克隆法,将VEGF121定向克隆入pEGFP-C1的多克隆位点,构建pEGFP/hVEGF121重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的MSC,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达。结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF121正确连接至pEGFP-C1的多克隆位点,pEGFP/hVEGF121重组质粒转染MSC后,荧光显微镜及免疫细胞化学检测EGFP/VEGF蛋白在MSC中存在表达。结论:成功构建了携带人VEGF121及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并在MSC中获得表达,为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病及MSC的分化奠定了实验基础。 展开更多
关键词 内皮生长因子 绿色荧光蛋白 融合蛋白质类 基因表达 骨髓 间质干细胞
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重组融合蛋白 Fab/IFN-αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用 被引量：2
11
作者 田文 宋少柏 +5 位作者 逯好英 檀华 郑伟 唐云 王琰 余燕星 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期204-206,共3页
关键词 重组融合蛋白质类 Fab/INFαA 乙型肝炎 HBV
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重组Klenow-HSA融合蛋白的构建、纯化及其稳定性 被引量：2
12
作者 曾令娥 黄晶 +3 位作者 白惠卿 范慧 黄大无 王露 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期684-687,共4页
目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯... 目的 :提高Klenow酶的热稳定性和储藏稳定性。方法 :利用PCR的方法扩增DH5α染色体DNA ,构建编码Klenow和人血清白蛋白第三功能区 (HSA D3)的融合蛋白表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。分别对Klenow酶和Klenow HSA融合蛋白进行纯化 ,并进行活性及稳定性的研究。结果 :发现Klenow HSA融合蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达。体外实验证实这种融合蛋白具有与Klenow聚合酶相同的活性 ,其稳定性明显提高。结论 :融合蛋白确实能增加Klenow酶的热稳定性和储存稳定性 。 展开更多
关键词 DNA聚合酶 I/生物合成 人血清白蛋白 重组融合蛋白质类/生物合成 DNA聚合酶 I Klenow片段
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重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 被引量：2
13
作者 赵亮 姚丽娟 +4 位作者 孔建新 濮跃晨 孙安源 罗以勤 张林杰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第4期357-361,共5页
目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/t... 目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子α 重组融合蛋白质类 遗传载体 真核细胞
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PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞增殖的影响 被引量：2
14
作者 黄峥兰 季茂胜 +5 位作者 袁颖 黄世峰 刘钉宾 曾建明 温健萍 冯文莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期849-852,856,共5页
目的研究PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞株增殖的影响。方法将前期制备的PTD-OD-HA融合蛋白作用于两种BCR-ABL阳性细胞株BaF3-P210和K562,同时设立PBS和OD-HA融合蛋白对照组,用MTT法检测细胞的生长情况。48h后离心收集细胞,用瑞氏... 目的研究PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞株增殖的影响。方法将前期制备的PTD-OD-HA融合蛋白作用于两种BCR-ABL阳性细胞株BaF3-P210和K562,同时设立PBS和OD-HA融合蛋白对照组,用MTT法检测细胞的生长情况。48h后离心收集细胞,用瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态改变,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化,RT-PCR、Westernblot-ting检测c-myc、cyclinD1mRNA及蛋白表达的变化。结果 MTT检测发现,与PBS和OD-HA对照组比较,PTD-OD-HA能抑制BCR-ABL阳性细胞株的生长。瑞氏染色及透射电镜观察见PTD-OD-HA处理的细胞胞质内有大量空泡样变,出现大量的溶酶体,线粒体广泛扩张;FCM检测发现G1期细胞比例增加,S期和G2期细胞比例减少;RT-PCR及Westernblotting检测发现c-myc、cyclinD1的mRNA及蛋白水平均降低。结论 PTD-OD-HA融合蛋白可抑制BCR-ABL阳性细胞生长,使细胞形态发生改变,并使细胞阻滞在G1期,这些改变可能是通过下调c-myc、cyclinD1的表达实现的。 展开更多
关键词 白血病 髓样 慢性 融合蛋白质类 bcr-abl 细胞增殖
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CCL21-CD40L融合蛋白的肿瘤免疫实验研究 被引量：2
15
作者 宫婷 李鸿立 巴一 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期498-503,共6页
目的:探讨CCL21-exCD40L融合基因的抗肿瘤作用。方法:构建CCL21-exCD40L真核表达载体,Western blot法检测CCL21-exCD40L融合蛋白的表达,Transwell法检测CCL21-exCD40L融合基因趋化活性,体外转染CCL21-exCD40L融合基因,观察其在小鼠结肠... 目的:探讨CCL21-exCD40L融合基因的抗肿瘤作用。方法:构建CCL21-exCD40L真核表达载体,Western blot法检测CCL21-exCD40L融合蛋白的表达,Transwell法检测CCL21-exCD40L融合基因趋化活性,体外转染CCL21-exCD40L融合基因,观察其在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤作用。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L,Transwell法验证融合蛋白对树突细胞具有较强趋化功能,其每高倍镜视野穿膜细胞数是空载体对照组的14.95倍。将融合基因原位转染肿瘤局部,荷瘤小鼠全部存活,肿瘤体积缩小。结论:CCL21-exCD40L融合基因能通过真核细胞正常表达,CCL21-exCD40L融合蛋白能够趋化树突细胞,在体内发挥抗肿瘤作用。 展开更多
关键词 趋化因子CCL21 CD40配体 重组融合蛋白质类 基因疗法 结肠肿瘤 疾病模型 动物
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蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定 被引量：2
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作者 陈欣虹 刘琼 詹金彪 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2005年第3期201-206,共6页
　目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;... 　目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a(+);在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性。结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性。结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究。 展开更多
关键词 蓖麻蛋白 蓖麻毒素A链 发光蛋白质类 重组融合蛋白质类/生物合成 基因表达 大肠杆菌/代谢 聚合酶链反应
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CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在K562细胞中的定位及其与BCR-ABL蛋白的相互作用 被引量：2
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作者 肖恒 王海霞 +4 位作者 陶崑 刘鑫 钟梁 黄世峰 冯文莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期896-899,共4页
目的研究CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA两种融合肽在慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞中的定位及其与BCR-ABL蛋白的相互作用。方法将前期制备的CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽转导入K562细胞,采用免疫荧光和Western blotting方法检测其入胞情况... 目的研究CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA两种融合肽在慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞中的定位及其与BCR-ABL蛋白的相互作用。方法将前期制备的CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽转导入K562细胞,采用免疫荧光和Western blotting方法检测其入胞情况及胞内定位,His-pull down和CoIP实验检测融合肽与BCR-ABL的相互作用。结果免疫荧光检测显示CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能穿过细胞膜进入细胞并定位于胞质,Western blotting也同时检测到进入细胞质中的两种融合肽。His-pull down实验结果表明,CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在细胞外均可直接与BCR-ABL蛋白结合,CoIP实验结果显示两种融合肽在K562细胞内也能与BCR-ABL蛋白结合并形成复合物。结论 CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能成功进入白血病K562细胞并定位于细胞质,且可与BCR-ABL蛋白发生相互作用。 展开更多
关键词 白血病 粒 单核细胞 慢性 融合蛋白质类 bcr-abl
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s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位 被引量：1
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作者 宋忆淑 宋志宇 +2 位作者 费向东 贺冰 李玉新 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期39-41,共3页
目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s-... 目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s- lap/ GFP融合基因转入 Hela细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达。结果 :s- lap/ GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示 ,在转染 GFP基因的 Hela细胞中 ,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染 s- lap/ GFP融合基因的 Hela细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论 :s- lap/ GFP融合蛋白可在人 Hela细胞中表达 ,并主要定位于细胞核。 展开更多
关键词 s-lap/GFP融合蛋白 重组融合蛋白质类/遗传学 基因融合/方法 HELA细胞
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重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性 被引量：2
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作者 孙文霞 谭云洪 +3 位作者 袁仕善 谭笑 夏燕 陈婧 《中国防痨杂志》 CAS 2010年第6期306-309,共4页
目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆... 目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。结论重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 重组融合蛋白质类 细菌蛋白质类
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重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立 被引量：3
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作者 张光满 秦宜德 于爱平 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2010年第4期567-569,共3页
目的建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的蛋白。结果纯化后的STH纯度为98... 目的建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的蛋白。结果纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%。结论建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。 展开更多
关键词 重组融合蛋白质类/分离和提纯 色谱法 离子交换
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