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茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达 被引量:2
1
作者 王乃栋 张丽霞 +2 位作者 黄晓琴 韩晓阳 李智 《茶叶科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期269-275,共7页
以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕... 以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。 展开更多
关键词 茶树 多酚氧化酶 融合蛋白真核表达载体 巴斯德毕赤酵母 诱导表达
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HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达 被引量:1
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作者 谢尧 陶其敏 《北京医科大学学报》 CSCD 1999年第1期38-40,共3页
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体。方法:用PCR方法扩增HBVpreS和HCVE2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入... 目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体。方法:用PCR方法扩增HBVpreS和HCVE2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白。结果:E2preS融合蛋白基因包括了全长的HBVpreS和HCVE2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6kb。表达载体在COS7细胞表达出了E2preS融合蛋白。结论:构建的E2preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒 融合蛋白 载体表达
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施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
3
作者 仇槿昕 侯辉 +2 位作者 孙法壮 冯耀宇 李维克 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第3期39-45,共7页
施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)是一种新型正布尼亚病毒,主要感染牛、绵羊和山羊等反刍动物。SBV的核衣壳蛋白(N)已被证明是血清学检测的理想靶抗原。本研究将SBV N基因的全长编码序列克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-2... 施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)是一种新型正布尼亚病毒,主要感染牛、绵羊和山羊等反刍动物。SBV的核衣壳蛋白(N)已被证明是血清学检测的理想靶抗原。本研究将SBV N基因的全长编码序列克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-SBV-N,转化至Rosseta感受态细胞中,IPTG诱导表达N蛋白。采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化His-SBV-N蛋白,以获得的N蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后取效价高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,制备得到针对SBV N蛋白的单克隆抗体(McAbs),并通过间接ELISA筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。最终获得3株稳定分泌抗N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B1、2B2和3F2。抗体亚型鉴定均为IgG2a。Western blot和ELISA检测结果表明,这3株单抗在酶联免疫吸附试验中与重组SBV N蛋白具有良好的反应性,重组N蛋白的表达和单抗的成功制备为SBV的血清学诊断提供了重要材料。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒 衣壳蛋白 表达 细胞融合 单克隆抗体
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带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响 被引量:3
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作者 纪宗玲 陈苏民 +5 位作者 刘断中 吴元明 张俊杰 路凡 朱帮福 李毅 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期1445-1448,U002,共5页
目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGF... 目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。 展开更多
关键词 基因表达 细胞形态 细胞周期 人era表达载体 绿色荧光蛋白 ERA基因
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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量:3
5
作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页
【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多
关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌型表达载体 表达
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人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建 被引量:2
6
作者 杨爱玲 徐琛蓉 +3 位作者 章锦才 钟良军 殷春一 赵川江 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期133-135,共3页
目的 构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法 采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组... 目的 构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法 采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果 ①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论 用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。 展开更多
关键词 人釉原蛋白 重组质粒 编码区基因表达载体 基因治疗
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凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建 被引量:6
7
作者 于利利 王泽华 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期489-491,499,共4页
目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRN... 目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到空载体Pgenesil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功,并被成功转入宫颈癌HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达,48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 LIVIN shRNA表达载体 HELA细胞
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CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV^+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响 被引量:3
8
作者 朱伟 黎桂仙 +2 位作者 陈洪浪 尹金宝 姜恩平 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期424-429,I0001,共7页
目的:构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV+)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:根据重叠延伸原理,将LMP2A与G... 目的:构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV+)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV+肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果:酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV+肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论:重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV+CNE2细胞增殖且促进其凋亡。 展开更多
关键词 潜伏膜蛋白2A 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 融合基因 表达载体
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抗HIV-1 gp120单链抗体导向SEAD227A融合蛋白原核温控型表达载体构建及表达 被引量:2
9
作者 王宏 金宁一 +4 位作者 金洪涛 张立树 江文正 徐一鸣 连海 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2004年第11期38-41,共4页
人工合成了能广泛识别HIV—1 gp120的单链抗体(SeFv120)基因和金黄色葡萄菌外毒素A(SEA)基因,将SEA基因第227位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码Ala(A)的密码子GCT,并对两基因进行密码子优化。构建原核温控型表达质粒pBV—120和pBV—S... 人工合成了能广泛识别HIV—1 gp120的单链抗体(SeFv120)基因和金黄色葡萄菌外毒素A(SEA)基因,将SEA基因第227位编码Asp(D)的密码子GAT转换成编码Ala(A)的密码子GCT,并对两基因进行密码子优化。构建原核温控型表达质粒pBV—120和pBV—SL120,经条件优化,pBV—120和pBV—SL120分别在E.coli BL21(DE3)plys中44℃诱导6h、42℃诱导7h获得最佳表达,表达量分别占菌体总蛋白的27.673%和32.519%。目的蛋白经包涵体洗脱、分子筛层析折叠复性后可与HIV—1抗原条发生良好的结合反应。 展开更多
关键词 GP120 单链抗体 HIV—1 抗HIV-1 基因 BV 密码子 表达载体构建 融合蛋白
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含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建 被引量:2
10
作者 朱建中 卢春 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期453-454,共2页
目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中... 目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 人疱疹病毒8型 K12基因 重组表达载体 构建
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IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建
11
作者 陈其新 陈凌娜 陈正华 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期301-306,共6页
将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等... 将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列. 展开更多
关键词 IL15/PAP融合蛋白 表达载体 构建
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金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建 被引量:1
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作者 谭洁莹 付欣 李冰 《实用医学杂志》 CAS 2008年第14期2370-2372,共3页
目的:构建表达金属硫蛋白(metallo thionein,MT)的非融合性原核表达载体。方法:以大肠杆菌BL21中的PET-GST-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pBV220载体,转入大肠杆菌DH-5α中。结... 目的:构建表达金属硫蛋白(metallo thionein,MT)的非融合性原核表达载体。方法:以大肠杆菌BL21中的PET-GST-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pBV220载体,转入大肠杆菌DH-5α中。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致,测序结果正确。结论:成功构建MT原核表达载体,为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础。 展开更多
关键词 金属硫蛋白 基因重组 pBV220载体 融合表达
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重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究 被引量:8
13
作者 黄波 冯作化 +1 位作者 张桂梅 李东 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第3期168-172,共5页
目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 1... 目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。 展开更多
关键词 pCH510质粒 基因转染 化疗 肿瘤 小鼠 重组FN多肽表达载体
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重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应 被引量:4
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作者 杨欣伟 隋延仿 +5 位作者 李增山 曲萍 叶菁 武文 董海龙 张秀敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期443-446,共4页
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。... 目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。 展开更多
关键词 重组SEA基因表达载体 肝癌 超抗原 肝癌 CTL 免疫效应 动物实验
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羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性 被引量:6
15
作者 李鸿钧 马雁冰 +1 位作者 戴长柏 孙茂盛 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期139-142,共4页
Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变... Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变性条件下经羟胺切割、柱层析纯化后复性 ,获得纯度达 90 %以上的 rh NTN.经鸡胚背根神经节 (DRG)培养法测定具有生物学活性 . 展开更多
关键词 NEURTURIN 融合蛋白 羟胺切割 鸡胚背根神经节 纯化 生物活性 基因表达 载体
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单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建 被引量:7
16
作者 成党校 钱桂生 黄桂君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第8期807-809,共3页
目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆... 目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论 应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。 展开更多
关键词 单羧酸转运泵 肿瘤 MCT1基因 反义表达载体
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人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达 被引量:7
17
作者 赵善超 刘靖华 +4 位作者 李志杰 秦清和 邓鹏 侯凡凡 姜勇 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第12期1314-1316,共3页
目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PC... 目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 人晚期糖基化终产物受体 融合蛋白 载体 基因表达
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pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达 被引量:5
18
作者 刘军 肖颂华 +2 位作者 陶恩祥 邢诒刚 梁秀龄 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期255-257,I001,共4页
目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴... 目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。 展开更多
关键词 pCDNA3-AADC表达载体 构建 原代培养 骨骼肌细胞 芳香族氨基酸脱羧酶 免疫印记 帕金森病
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利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白 被引量:7
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作者 王林美 张波 +5 位作者 叶博 赵振军 李树英 李文利 岳冬梅 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期792-799,共8页
为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培... 为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12~18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30~39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。 展开更多
关键词 柞蚕蛹 型多角体病毒表达载体系统 增强型绿色荧光蛋白基因 樗蚕培养细胞
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骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达 被引量:3
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作者 杜红延 王捷 +3 位作者 郭勇 郑霖 杨静 刘大志 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期410-412,共3页
目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法从构建好的pB hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切... 目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法从构建好的pB hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2EGFP,构建重组载体pIRES2hBSP EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA MB231BO中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果成功构建hB SP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论真核表达载体pIRES2hBSP EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。 展开更多
关键词 骨唾液蛋白 荧光蛋白 乳腺癌细胞 基因转染 稳定表达 融合荧光蛋白载体 特异性骨转移
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